猪肺炎支原体诱导猪肺泡巨噬细胞基因差异表达谱研究

发布时间：2016-11-06 10:29

  本文关键词：猪肺炎支原体诱导猪肺泡巨噬细胞基因差异表达谱研究，由笔耕文化传播整理发布。

《湖南农业大学》 2015年

猪肺炎支原体诱导猪肺泡巨噬细胞基因差异表达谱研究

王贵平  

【摘要】：猪支原体肺炎(MPS),是一种由猪肺炎支原体(Mhp)引起的猪慢性呼吸道病。MPS在世界范围内流行,在我国也长期存在,严重影响了养殖业的发展。MPS逐渐被国内外研究学者所重视,对其研究的相关报道也较多,这些报道多集中在疫苗开发、病原学、药物及诊断方面。MPS典型病理变化包括支气管周围炎、淋巴细胞浸润增生、肺肉变和间质性肺炎等；典型临床症状包括喘气、消瘦及恶病质等。MPS典型病理变化和临床症状发生机理、相关信号传导途径以及相关细胞因子在疾病发生过程中的作用较少见到相关文献报道。本试验将从下列两方面进行研究。1、长沙市及周边地区MPS病原流行病学调查。从长沙市及周边地区采集了1260份猪样品：鼻拭子45份,气管拭子81份,支气管肺泡灌洗液469份,猪肺625份和血液40份。对采集的样品用PCR和序列分析的方法进行了猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp)和猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis, Mhr)检测；对Mhr进行了分离并初步鉴定。结果表明,Mhp和Mhr在长沙市及周边地区猪群中,最佳待检样品是：冬季收集的屠宰猪支气管肺泡灌洗液(Mhp)和猪鼻拭子(Mhr)。本研究结果为长沙市及周边地区MPS防制及Mhp和Mhr检测提供了新的流行病学依据。2、猪肺炎支原体诱导猪肺泡巨噬细胞基因差异表达谱研究。本试验用Mhp刺激体外培养的PAM,以RPMI-1640培养液孵育PAM为对照,分别作用12h和24h后提取细胞总RNA,构建cDNA文库,用数字基因表达谱(DGE)技术对其进行检测并对检测结果进行了GO分析、KEGG分析、IPA分析和STRING分析。结果显示,与对照组相比,Mhp诱导PAM 12小时后PAM转录组中有86个基因显著差异表达,其中49个表达上调,37个表达下调；Mhp诱导PAM 24小时后PAM转录组中有889个基因显著差异表达,其中517个表达上调,372个表达下调。GO分析发现Mhp诱导PAM 12小时后差异显著GO富集项有54项：1、“生物进程”类别：46项,功能描述主要为炎症反应、免疫应答和信号传导控制等；2、“分子功能”类别：5项,功能描述为细胞因子活性、细胞因子受体结合和TNF受体结合；3、“细胞组分”类别：3项,功能描述为细胞周边(细胞外间隙,充满细胞外基质和细胞外液)。GO分析发现Mhp诱导PAM 24小时后差异显著GO富集项有128项：1、“生物进程”类别：106项,功能描述主要为：炎症反应、免疫系统活性、防御反应、免疫应答和白细胞激活等；2、“分子功能”类别有11项,功能描述主要为：趋化因子活性、趋化因子受体结合、蛋白结合和催化活性等；3、“细胞组分”类别有11项,功能描述主要为：细胞周边、细胞表面、细胞质和细胞内等。分析发现Mhp诱导PAM 24小时后(与诱导12小时相比),富集项数量增多,并且相同的GO富集项所含有的差异基因数量不同程度增加。诱导PAM 12小时后,Mhp可能主要作用于PAM的细胞周边,利用细胞因子与其受体相互作用启动初始信号传递参与免疫反应；诱导PAM 24小时后,Mhp可能在PAM细胞内外同时作用,通过信号传递和免疫应答反应介导机体出现相应的病理症状。KEGG分析发现Mhp诱导PAM 12小时后,差异基因集中在101个KEGG富集项中,其中提示与MPS密切相关的差异基因主要集中在下列4个KEGG富集项：Toll样受体信号通路、细胞因子-细胞因子受体互作通路、T细胞受体信号通路和抗原递呈加工通路。Mhp诱导PAM 24小时后,差异基因集中在250项KEGG富集项中,其中提示与MPS密切相关的差异基因主要集中在NF-K.B信号通路、内吞作用通路、趋化因子信号通路、Toll样受体信号通路、细胞因子-细胞因子受体互作通路、T细胞受体信号通路和抗原递呈加工通路等7个KEGG富集项。Mhp诱导PAM 24小时后(与诱导12小时相比),KEGG富集项数量增多,并且相同的KEGG富集项所含有的差异基因数量不同程度增加。诱导PAM 12小时后,Mhp可能首先启动Toll受体信号通路将Mhp相关信号向PAM传递,并且刺激PAM启动免疫应答；诱导PAM24小时后,Mhp通过信号传递介导吞噬反应和趋化因子的激活对Mhp进行反调控,形成二者相互作用的状态。IPA分析发现Mhp诱导PAM 24小时后,差异基因相互连接形成25个内部相互作用的子网络(子网络1-25)。结合相关文献,提示子网络7和子网络15中分别有6个和8个基因与MPS密切相关。在子网络1-25中与MPS临床症状和病理变化密切相关的差异基因主要有：IL8、TNFa、CCL3、CCL5、CCL8和TGFβ1等。STRING分析发现有131个差异基因编码蛋白参与了网络互作,其中有13个提示与MPS密切相关的蛋白相互作用形成CCL子网络。编码CCL子网络蛋白的13个差异基因中有8个参与了基因互作子网络(IPA分析)。根据DGE技术检测结果及GO分析、KEGG分析、IPA分析和STRING分析结果,分析发现MPS典型病理变化和临床症状形成过程可能与本试验中Mhp通过PAM调控相关基因差异表达密切相关。Mhp感染猪后形成支气管周围炎,PAM向炎灶部位集聚并被激活,激活的PAM可分泌IL1(12小时表达量升高3.64倍,24小时升高8.37倍)和IL8(24小时表达量升高2.91倍)等炎性细胞因子,致使机体出现炎症应答反应过程,以淋巴细胞、中性粒细胞为主的炎性细胞渗出血管外,在CCL3(24小时表达量升高5.76倍)、CCL5(24h表达量升高3.72倍)和CCL8(24小时表达量升高23.45倍1等趋化因子作用下向炎灶部位(支气管和细支气管周围)集聚和浸润,进一步导致淋巴滤泡形成;Mhp感染猪后形成支气管周围炎,活化的PAM向炎灶部位集聚,分泌和释放TGFβ1(24小时升高2.91倍),促使肺纤维化和肺间质增宽,进一步出现间质性肺炎；Mhp感染猪后诱导PAM大量分泌IL1(12小时表达量升高3.64倍,24小时升高8.37倍)和IL8(24小时表达量升高2.91倍)。IL1表达量的升高进一步引起的TNF(24小时表达量升高3.68倍)分泌。IL8和TNF表达量升高可促使动物机体出现恶病质、发热、疲劳和食欲减退,进一步促使患猪日益消瘦、疲劳、食欲降低、体重减轻。本研究为MPS的致病机理研究提供了参考依据,有助于完善Mhp影响PAM功能的分子机理,为进一步阐明Mhp通过PAM促进MPS的形成提供了新的线索和依据。

【关键词】：
【学位授予单位】：湖南农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.28
【目录】：

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