氧化应激在Eimeria tenella宿主细胞线粒体调亡途径中的作用和机制
本文选题：氧化应激 切入点：柔嫩艾美耳球虫 出处：《山西农业大学》2016年博士论文
【摘要】：艾美耳球虫是对全球养鸡业危害严重的寄生虫疾病,往往造成严重的经济损失。在已知的鸡艾美耳球虫中,E.tenella是对机体损伤最为严重的一种,主要寄生于鸡的盲肠上皮细胞内,破坏盲肠上皮细胞,造成盲肠出血,形成血便,最终导致鸡的死亡。在E.tenella对机体造成严重损失的过程中,盲肠上皮细胞的凋亡是其损伤的一种主要方式。线粒体途径是E.tenella感染宿主细胞凋亡的通路之一。氧化应激是E.tenella感染机体所造成的一种结果,氧化应激与线粒体途径介导的细胞凋亡之间的关系如何,在E.tenella所诱导的线粒体凋亡途径中发挥怎样的作用及其机制如何,这正是本试验想要解决的问题。本试验采用鸡盲肠上皮细胞原代培养技术、流式细胞术、实时荧光定量PCR、酶联免疫法、分光光度法,从分子和细胞水平研究氧化应激在E.tenella感染宿主细胞线粒体凋亡通路中的作用与机理,并通过ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸、NOS抑制剂L-NMMA,NOX抑制剂夹竹桃麻素、XO抑制剂非布索坦、mitoKATP通道开放剂二氮嗪对感染E.tenella的鸡盲肠上皮细胞进行预处理,检测细胞培养液中H202和NO水平,细胞中NOS及caspase 9活性、细胞中磷酸化JNK和磷酸化p38水平,MPTP开放程度,线粒体及细胞质中cyt c含量、细胞中BCL-2和BAX基因的mRNA及蛋白表达水平,从而探明ROS与NO在E.tenella感染的鸡盲肠上皮细胞凋亡过程的作用机制。试验结果表明：(1) E.tenella感染+夹竹桃麻素处理组(T1组)、E.tenella感染+非布索坦处理组(T2组)的E.tenella感染率与E.tenella感染组(T组)在E.tenella子孢子感染后各时间点差异不显著(P0.05),这表明抑制细胞内ROS生成酶的活性与E.tenella的感染率之间没有显著的相关性。E.tenella感染+L-NMMA处理组(T3组)的E.tenella感染率在感染后96 h、120h显著(P0.05)或极显著地(P0.01)高于T组,表明抑制NO的生成有利于E.tenella在细胞内的发育。E.tenella感染+N-乙酰半胱氨酸处理组(T4组)的E.tenella感染率在E.tenella子孢子感染后24 h、96 h、120 h显著(P0.05)或极显著地(P0.01)低于T组,表明清除细胞内的ROS可以降低E.tenella在细胞内的感染率。E.tenella感染+二氮嗪处理组(T5组)的E.tenella感染率在感染后96h、120h极显著地(P0.01)高干T组.这表明开放mitoKATP通道可以抑制宿主细胞凋亡,延长E.tenella在细胞内的发育时间,有利于E.tenella的发育,提高宿主细胞的感染率。(2)T组细胞内ROS和NO水平分别在感染后24h-120 h和24 h-96 h极显著地(P0.01)高于C组,表明感染E.tenella会导致宿主细胞氧化应激反应。(3)T1组细胞内NOX活性和ROS水平分别在感染后4h-120h和24 h-120 h极显著地(P0.01)低于T组；T2组细胞内XO活性和ROS水平在感染后24 h-120 h极显著地(P0.01)低于T组：T3组细胞内NOS活性和NO水平分别在感染后4 h、24 h、72 h、120h和4h-120h显著(P0.05)或极显著地(P0.01)低于T组,这表明感染E.tenella的盲肠上皮细胞的ROS和NO增多可由NOX、XO和NOS激活而引起。(4)感染鸡胚盲肠上皮细胞后24 h-120 h,T组细胞培养液中H202含量和NO水平极显著(P0.01)或显著(P0.05)高于C组,表明细胞产生的ROS和NO可以释放于细胞外。(5) E.tenella子孢子感染鸡胚盲肠上皮细胞后24 h-120 h和24 h、72 h、96 h、120 h,T3组和T4组细胞早期凋亡率分别在感染后显著(P0.05)或极显著地(P0.01)低于T组。表明抑制NO的生成、清除ROS可以有效地减少因感染E.tenella而引起的细胞早期凋亡。(6)T3组和T4组细胞MPTP开放程度分别在感染后48 h和24 h极显著地(P0.01)低于T组,表明氧化应激可以部分促进E.tenella感染宿主细胞MPTP的开放。(7)T3组和T4组的细胞caspase9活性分别在感染后24h-120h和48h-120h显著(P0.05)或极显著地(P0.01)低于T组；T3组和T4组细胞线粒体内cyt c水平分别在感染后24 h、48 h、96 h、120 h和48 h、96 h、120 h显著(P0.05)或极显著地(P0.01)高于T组；T3和T4组胞浆cytc水平在感染后24 h-120 h显著(P0.05)或极显著地(P0.01)低于T组,表明E.tenella感染引发的氧化应激可通过线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡。(8)T3组和T4组胞细内磷酸化JNK和磷酸化p38水平分别在感染后4 h-120 h和4 h、24 h、48 h、72 h、120 h显著(P0.05)或极显著地(P0.01)低于T组：T3和T4组细胞BCL-2蛋白表达分别在感染后4h、48 h、72h、120h和4h-72h显著(P0.05)或极显著地(P0.01)高于T组；T3组和T4组细胞内BAX蛋白表达在感染后24h-96h极显著地(P0.01)低于T组;T3和T4组细胞BCL-2 mRNA表达水平分别在感染后24 h-120 h和24h、72 h、96 h、120 h极显著地(P0.01)高于T组：T3和T4组细胞BAXmRNA表达水平分别在感染后4h、48h、72h、96 h、120 h和24 h-120 h显著(P0.05)或极显著地(P0.01)低于T组,表明氧化应激通过激活JNK和p38,并调控BCL-2和BAX的表达量进而影响细胞凋亡。(9)T5组的早期凋亡率与晚期凋亡和坏死率水平分别在感染后24 h、72 h、96h、120 h和48 h-120 h显著(P0.05)或极显著地(P0.01)低于T组,T5组的DNA损伤率、caspase 9和caspase 3活性在感染后24h-120h极显著低于T组(P0.01),表明开放mitoKATP通道可以通过抑制caspase 9和caspase 3活性降低因感染E.tenella而引起的细胞凋亡。(10)T5组的细胞内ROS和NO水平分别在感染后24 h、48 h、72 h、120 h和4 h、48 h、72 h极显著地(P0.01)低于T组;T5组的细胞培养液中的H202含量和NO水平分别在感染后4h-120h和48 h、72 h极显著地(P0.01)低于T组,表明开放mitoKATP通道可以降低因感染E.tenella而引起的ROS和NO水平的升高。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山西农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.31
【参考文献】
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，本文编号：1666463
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