猪圆环病毒Ⅱ型诱导Ⅰ型干扰素产生的信号途径

发布时间：2018-03-26 12:27

  本文选题：猪圆环病毒Ⅱ型　切入点：猪肺泡巨噬细胞　出处：《南京农业大学》2016年博士论文

【摘要】：猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2, PCV2)是一个小的共价闭合的单股环状负链DNA病毒。该病毒是断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic syndrome, PMWS)的主要病原,另外它与多种猪病密切相关,如繁殖障碍、肉芽肿性肠炎、猪皮炎肾病综合征等,给养猪产业造成巨大经济损失。本研究首先通过TMT标记的定量磷酸化蛋白组技术,对PCV2作用猪肺泡巨噬细胞(pulmonary alveolar macrophages, PAMs) 6 h后的差异磷酸化蛋白进行分析,共发现了 213个差异表达磷酸化蛋白;其中线粒体抗病毒信号(mitochondrial antiviral signaling protein, MAVS )磷酸化蛋白显著上调,提示PCV2引发先天免疫激活;进一步研究发现髓样分化因子88 (myeloid differentiation primary response gene88, MyD88),干扰素调节因子(interferon regulatory factors, IRFs ),DNA依赖的干扰素调节因子激活物(DNA-dependent activator of IFN-regulatory factors, DAI)和视黄酸诱导基因蛋白 1(retinoic acid induced gene-1,RIG-1 )在PCV2感染诱导Ⅰ型干扰素的产生中起着重要的作用;另外,研究表明RIG-1和DAI能够影响PCV2的复制,这些研究为阐明PCV2的免疫特性和感染机制奠定了理论基础。具体研究内容如下:1. TMT定量分析PCV2感染仔猪肺泡巨噬细胞差异磷酸化蛋白的表达猪巨噬细胞是PCV2在体内的靶细胞之一。为了深入研究PCV2作用原代培养PAMs磷酸化位点的变化情况,运用质谱分析定量的等量异位标签技术(Tandem Mass Tag, TMT ),对PCV2作用PAMs 6 h后的差异磷酸化蛋白进行分析,共发现了 213个差异表达磷酸化蛋白,其中87个磷酸化蛋白显著上调(含102个磷酸化位点),126个磷酸化蛋白显著下调(含178个磷酸化位点)。这些蛋白涉及生物结合、细胞骨架、信号转导与细胞黏附等。了解这些差异表达磷酸化蛋白,为进一步研究PCV2的致病机理提供了线索。2. NF-κB在PCV2诱导PAMs分泌Ⅰ型干扰素信号途径中的作用核转录因子κB( nuclear factor kappa B, NF-κB )通过与干扰素调节因子3 (interferon regulatory factor 3, IRF3 )和干扰素调节因子7 (interferon regulatory factor 7, IRF7)相互协作参与Ⅰ型干扰素分泌,在机体先天性免疫反应中发挥着重要作用。为了研究NF-κB在PCV2诱导PAMs分泌Ⅰ型干扰素信号途径中的作用,将无菌分离的PAMs,随机分为四组:对照组、PCV2组、NF-κB-抑制剂组(抑制剂组)和NF-κB抑制剂-PCV2组(抑制剂-PCV2组)进行体外培养。间接免疫荧光法(indirect immunoinfluscent assay,IFA)定位检测结果表明,PCV2可感染PAMs,并主要存在于细胞浆中;Western Blot方法检测结果表明,较强的NF-κB抑制剂BAY 11-7082抑制了抑制性κB (inhibitor of NF-κB, IκB)的磷酸化,进而抑制IκBα降解和随后的NF-κB核转运。ELISA方法检测培养上清液中α干扰素(interferon α, IFN-α)和β干扰素(interferon β, IFN-β )的动态变化,发现PCV2能诱导PAMs分泌IFN-α;而抑制NF-κB活化后,PCV2诱导PAMs分泌IFN-α的作用并未下降,表明NF-κB信号途径可能不参与PCV2诱导PAMs分泌IFN-Ⅰ的过程。3. PCV2通过MyD88-IRFs信号途径诱导PAMs Ⅰ型干扰素的表达为了进一步阐明PCV2引起PAMs分泌IFN-Ⅰ的信号途径,采用siRNA方法将MyD88基因沉默,探讨MyD88-IRFs信号途径在PCV2诱导PAMs分泌IFN-Ⅰ中的作用。结果表明,PCV2上调IFN-α基因转录与IKKα、IRF7和IRF3有极大的关系。干扰PAMs中MyD88基因后,减弱了 PCV2对IKKα、IRF3、IRF7和IFN-α的转录上调作用。另外,相关性分析发现IFN-α与IRF3,IRF7,MyD8 之间呈显著的正相关性,而IFN-β与IRF3、IRF7之间也呈显著的正相关性。这些结果都表明PCV2可以通过MyD88-IRF(s)信号途径影响Ⅰ型干扰素的表达。4. PCV2通过RIG-1和DAI影响PK15细胞产生Ⅰ型干扰素作用的初步研究RIG-1和DAI是Ⅰ型干扰素产生途径的上游信号分子。为了研究RIG-1和DAI是否影响PCV2诱发的Ⅰ型干扰素产生,针对猪RIG-1和DAI基因的保守区分别设计4对siRNA序列,同时设计1对阴性对照siRNA序列,构建重组慢病毒。将获得的浓缩重组慢病毒侵染PK15细胞,经嘌呤霉素抗性筛选,获得具有抗性的阳性细胞,单克隆筛选后,通过荧光定量PCR和Western Blotting的方法验证干扰效率,成功获得了细胞内RIG-1和DAI基因和蛋白呈稳定低水平表达的PK15-shRIG-1和PK15-shDAI细胞系。用PCV2感染PK15-shRIG-1和PK15-shDAI细胞系后Ⅰ型干扰素产生水平显著下降;而且PK15-shRIG-1和PK15-shDAI细胞系中PCV2的复制能力显著降低。表明RIG-1和DAI信号可能参与了 PCV2诱导Ⅰ型干扰素的产生过程,并与PCV2在PK15细胞中的复制有关。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65

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本文编号：1667902