蜡梅热激蛋白70(HSP70)基因的克隆及功能分析

发布时间：2016-11-09 17:39

  本文关键词：蜡梅热激蛋白70(HSP70)基因的克隆及功能分析，由笔耕文化传播整理发布。

《西南大学》 2015年

蜡梅热激蛋白70(HSP70)基因的克隆及功能分析

NGUYEN VAN TIEN（阮文进）  

【摘要】：热激蛋白(Heat shock protein,HSP)是植物在高温、盐渍、干早、饥饿和重金属离子等环境胁迫下诱导合成的一类应激蛋白。在逆境条件下,热激蛋白作为分子伴侣促进其他蛋白的重新折叠、稳定、组装、胞内运输和降解,促进受损蛋白的修复和细胞的存活,从而对植物耐受逆境胁迫起着非常重要的作用。根据分子量的大小可分为HSP100、HSP90、HSP70、 HSP60、sHSP (small HSP)五大类。热激蛋白70(HSP70)是热激蛋白家族中重要的成员,广泛分布于细胞质、内质网、线粒体和叶绿体等细胞的各个部分,正常情况下与应激条件下都发挥重要的生理功能。蜡梅[Chimonanthus praecox(L.)Link]为中国特有的珍贵花木,冬季开花、花香清幽,是冬季最佳的切花材料。蜡梅在园林观赏方面广泛应用,其药用价值及食用价值也得到开发和利用。近年来,对蜡梅分子生物学水平的研究受到广泛关注。但对植物HSP70家族蛋白基因的研究较少,我们获得新的蜡梅热激蛋白基因并对其功能进行相关研究,有利于进一步明晰植物HSP70家族蛋白的功能,同时对探究蜡梅在逆境胁迫下的抗逆机制也具有积极作用。本论文从实验室已经构建好的蜡梅花转录组数据库中筛选出2个HSP70家族基因的EST序列,分别命名为E-CpHSP70-1和E-CpHSP70-2,通过E-CpHSP70-1和E-CpHSP70-2两个基因的时空表达分析,以E-CpHSP70-1基因为进一步研究对象。利用RACE技术克隆到E-CpHSP70-1基因的全长序列,并对其进行生物信息学分析、亚细胞定位分析和在转基因烟草及拟南芥中的异位表达研究。主要研究结果如下：1.蜡梅E-CpHSP70-1和E-CpHSP70-2基因表达特征分析采用实时荧光定量PCR技术分析蜡梅E-CpHSP70-1和E-CpHSP70-2基因在不同组织、不同花发育时期及不同温度胁迫下的表达模式,蜡梅E-CpHSP70-1和E-CpHSP70-2基因的表达均具有时空差异性。蜡梅E-CpHSP70-2基因在各个组织表达有显著差异,在花器官中的表达量明显高于营养器官,在盛开期的外瓣中表达量最高。蜡梅E-CpHSP70-1基因在各个组织器官都有表达,尤其在成熟叶中的表达量最高,在花的萌动期和露瓣期也有高丰度表达,因此推测该基因很可能参与调控植物叶片和花发育过程。E-CpHSP70-1基因在4℃低温胁迫1h后相对表达明显增强,在42℃高温处理0.25h后,该基因表达量也迅速上调,而在处理1h后表达量达到最高,说明,蜡梅E-CpHSP70-1基因可能参与调控蜡梅的高低温胁迫响应过程。蜡梅E-CpHSP70-2基因在各个组织表达也有显著差异,在花器官中的表达量明显高于营养器官,在盛开期的外瓣中表达量最高。蜡梅E-CpHSP70-2基因在低温及高温胁迫下,表达与对照相比均无显著差异。2.蜡梅CpHSP70-1基因的克隆及生物信息学分析利用RACE技术从蜡梅花转录组数据库中克隆到一个热激蛋白HSP70家族基因,命名为CpHSP70-1(基因登录号为KR071130)。该基因cDNA全长2520bp,编码653个氨基酸,含有TATA Box、CAAAT Box和CAAT Box等元件,这些元件通过与热激因子HSF结合来调控热激蛋白基因的表达,以响应不同的环境刺激。CpHSP70-1基因编码蛋白与其他物种的HSP70蛋白同源性较高,与小果野芭蕉、荷花、葡萄、水稻、可可的同源性都高达96%。CpHSP70-1基因编码蛋白的氨基酸序列含有三个典型的HSP70家族典型基序,两个交叉螺旋氨基酸基序,一个指纹基序,一个细胞质定位特征基序。聚类结果表明,CpHSP70-1基因编码蛋白与定位于细胞核或细胞质的HSP70蛋白聚为一枝,推测该蛋白可能是一个细胞器蛋白。而且该蛋白不含信号肽,仅含有一个较小的跨膜区域,亚细胞定位预测显示该蛋白主要定位于细胞核,进一步说明CpHSP70-1基因编码蛋白可能在细胞核内起作用。CpHSP70-1基因编码蛋白的二级结构包括40.43%的α螺旋、7.81%的p折叠、31.85%的无规则卷曲和19.91%的延伸链。该蛋白具有14个丝氨酸(Serine)磷酸化位点、13个苏氨酸(Thremnine)磷酸化位点和5个酪氨酸(Tyrosine)磷酸化位点,是一个亲水性蛋白,说明该蛋白可能在翻译后进行多种修饰作用,并且这些修饰作用在植物胁迫应答反应中起着重要作用。3.蜡梅CpHSP70-1亚细胞定位用BamHI和SalI快速内切酶分别对pMD 19-T/CpHSP70-1质粒和pCAMBIA 1300载体质粒进行双酶切,回收目的基因小片段和载体大片段后,连接并转化大肠杆菌,双酶切验证和PCR鉴定结果表明成功构建亚细胞定位表达载体pCAMBIA1300/CpHSP70-1,并采用基因枪法将重组质粒转化到洋葱表皮细胞中,瞬时表达结果表明CpHSP70-1蛋白在细胞核内表达。这也与基因的保守结构特征、聚类结果和亚细胞预测结果相吻合。4.蜡梅CpHSP70-1表达载体构建分别用BamHI和XbaI双酶切pMD 19-T/CpHSP70-1质粒和表达载体pCAMBIA2301G质粒,将回收目的片段连接,获得重组质粒pCAMBIA2301g/CpHSP70-1。5.蜡梅CpHSP70-1基因烟草以及拟南芥的遗传转化体系采用电击法,将含有目的基因的植物表达载体转化农杆菌GV3101,并通过农杆菌介导的叶盘法与花序侵染法分别转化烟草和拟南芥,经过卡那霉素(Kan)抗性筛选、GUS染色、DNA和RNA鉴定,获得9棵转基因烟草阳性植株和9个转基因拟南芥T3代纯合株系6.转CpHSP70-1基因植株的耐热性分析对不同表达量(高、中、低)的转基因烟草和转基因拟南芥进行耐热性分析和相关生理指标测定。烟草耐热性分析结果表明：野生型烟草植株在高温处理后叶片边缘卷曲、且出现萎焉、黄化现象,而转基因烟草表型无显著变化；相关生理指标测定结果表明,野生型烟草在高温胁迫后的MDA含量增幅比转基因烟草显著,其叶绿素分解速率也明显快于转基因烟草植株,而转基因烟草植株的脯氨酸含量和SOD活性增幅均大于野生型烟草。转基因拟南芥MDA、脯氨酸和SOD等生理指标结果与烟草变化趋势基本一致；且转基因拟南芥相对电导率在高温处理后变化幅度较野生型拟南芥小；另外,高温处理后转基因拟南芥种子萌发率明显高于野生型对照；下胚轴延伸长度也更显著；高温处理后野生型拟南芥平板幼苗和土壤幼苗均出现严重萎焉,且植株存活率远低于转基因拟南芥。对高温处理后CpHSP70-1基因在不同转基因株系中的表达情况进行实时荧光定量PCR检测,发现随着高温时间的延长,该基因在各个转基因株系叶片中的表达均呈上升趋势。说明高温处理条件下CpHSP70-1基因可能通过在转基因植株中的积累,影响了MDA、脯氨酸等的合成,继而提高了植株的耐热性。

【关键词】：
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S685.99
【目录】：

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1 任莉萍;曹小汉;;热休克蛋白研究进展[J];安徽农业科学;2006年10期

2 向珣,李成琼,雷建军;热激蛋白与植物抗热性研究进展[J];北方园艺;1999年04期

3 徐小万;曹必好;陈国菊;陈清华;雷建军;;蔬菜耐热综合评价研究进展[J];长江蔬菜;2008年02期

4 李慧聪;郭秀林;王冬梅;李国良;;玉米热激蛋白70基因对温度胁迫的响应[J];河北农业大学学报;2010年06期

5 张建国,何彩云,段爱国,殷继艳;植物热激蛋白研究进展[J];福建林学院学报;2005年02期

6 侯夫云;张立明;王庆美;李爱贤;张海燕;董顺旭;;植物耐非生物胁迫的分子机制[J];分子植物育种;2007年S1期

7 陈立松,刘星辉;植物抗热性鉴定指标的种类[J];干旱地区农业研究;1997年04期

8 李忠光;郭颖;杨双梅;张陆启;余艳;赵义霞;;热激诱导的玉米幼苗耐热性及其与脯氨酸的关系[J];广西植物;2010年03期

9 周丽;何非;潘秋红;段长青;;热休克蛋白在植物抗逆反应中的作用[J];热带生物学报;2011年04期

10 杨国正,张秀如,孙湘宁,李万九;棉花热激蛋白产生规律的初步研究[J];华中农业大学学报;1997年01期

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1 缪旻珉;黄瓜（Cucumis sativus L.）热伤害与热适应生理机制及耐热栽培技术研究[D];南京农业大学;2000年

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1 潘佳佳;百合小热激蛋白的克隆及初步分析[D];兰州大学;2010年

2 赵志新;四季海棠（Begonia semperflorens）高频再生及农杆菌介导的遗传转化体系的建立[D];西南大学;2013年

3 朱喜荣;菊花CgHSP70基因的克隆与功能鉴定[D];南京农业大学;2011年

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1 郑昭英,孙小镭,刘世琦,高俊凤;乙烯在黄瓜体内分布及周年变化动态研究初报[J];山东农业科学;2003年04期

2 梁太波,张淑香,史春余,王汝娟,杨馥成;活力素对菠菜产量及硝酸盐含量的影响[J];山东农业科学;2005年01期

3 曹世彪,陈双臣,李志娟;土壤调理剂对温室番茄产量品质的影响[J];山东农业科学;2005年03期

4 叶宝兴,毛达超,刘学春;超级小麦生育后期根系活力与净光合速率相关性的研究[J];山东农业科学;2005年04期

5 宋瑞勇;金忠华;张丽阳;;水分胁迫下复合微生物菌剂对玉米根系性状的影响[J];山东农业科学;2006年03期

6 孙慧敏;于振文;颜红;史桂萍;;不同土壤肥力条件下施磷量对小麦产量、品质和磷肥利用率的影响[J];山东农业科学;2006年03期

7 于惠敏;侯丙凯;;番茄基因工程及生物反应器研究与开发进展[J];山东农业科学;2007年02期

8 刘文宝;李青;段友臣;侯涛;杨鹏;张文杰;朱振林;王芳;;S-诱抗素在花生抗旱栽培上的应用效果初报[J];山东农业科学;2007年05期

9 萧蓓蕾;李德全;胡晓丽;;盐胁迫对转ZmPP2C2基因烟草和野生型烟草叶片膜脂过氧化及体内保护系统的影响[J];山东农业科学;2008年01期

10 于文艳;刘世琦;梁庆玲;郝树芹;;大蒜二倍体与四倍体生长和生理指标的比较研究[J];山东农业科学;2008年02期

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1 郑艺梅;郑琳;华平;胡秋丽;黄霞;;糙米发芽过程中营养成分及抗营养因子变化的研究[A];安徽省第五届“兴皖之光”青年学术年会论文集（农科卷）[C];2005年

2 裴孝伯;解静;余纪柱;;不同南瓜砧木嫁接对黄瓜果实Vc、可溶性糖和蛋白质的影响[A];现代农业理论与实践——安徽现代农业博士科技论坛论文集[C];2007年

3 马欢;刘伟伟;王秀菊;刘士清;李建昌;张无敌;;不同阴离子在生物质发酵产氢中的作用研究[A];现代农业理论与实践——安徽现代农业博士科技论坛论文集[C];2007年

4 李孝良;李健姣;吕宝磊;陈效民;王晓洋;詹国飞;;肥料与石膏配施对滨海盐土玉米生理活性的影响[A];土肥水资源高效利用与农业面源污染防控技术研讨会论文集[C];2011年

5 陈丽平;赵方贵;李敏;杨延杰;陈宁;;几种蔬菜根浸提液对黄瓜幼苗的化感作用[A];山东园艺学会第七次会员代表大会暨学术研讨会论文集[C];2011年

6 李婷婷;张秀新;吕英民;;盆栽芍药有机生态型无土栽培基质配方筛选[A];中国观赏园艺研究进展2011[C];2011年

7 孔佩佩;杨树华;贾瑞冬;葛红;;不同丛枝菌根真菌对切花月季部分生理指标的影响[A];中国观赏园艺研究进展2011[C];2011年

8 钱仁卷;刘洪见;林霞;黄建;张旭乐;;不同苗龄无柄小叶榕对低温胁迫的生理响应研究[A];中国观赏园艺研究进展2011[C];2011年

9 许瑛;陈煜;陈素梅;张海平;陈发棣;管志勇;蒋甲福;;低温处理对菊花叶片SOD酶和CAT酶活性的影响[A];中国观赏园艺研究进展2011[C];2011年

10 房晓君;王奎玲;刘庆超;刘庆华;;铃兰耐阴性研究[A];中国观赏园艺研究进展2011[C];2011年

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1 顾春波;草莓枯萎病菌对多菌灵及戊唑醇的抗性研究[D];山东农业大学;2010年

2 王庆莲;苹果多胺和脯氨酸合成代谢相关基因的功能鉴定[D];山东农业大学;2009年

3 陈业兵;银胶菊化感潜力及其潜在化感物质的分离鉴定[D];山东农业大学;2010年

4 王俊忠;施氮对高产夏玉米源库代谢特征的调控[D];甘肃农业大学;2010年

5 种培芳;荒漠植物红砂、白刺和沙拐枣抗旱指标及抗旱性综合评价研究[D];甘肃农业大学;2010年

6 杨江山;保护性耕作对旱区小麦—菘蓝轮作土壤生态及作物生理特性的影响[D];甘肃农业大学;2010年

7 金光;海洋拮抗菌JG1的分离鉴定、应用及热激蛋白DnaK的保护机制初探[D];中国海洋大学;2010年

8 王丽燕;面包酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）对中国卤虫（Artemia sinica）抗弧菌感染的影响与酚氧化酶原在卤虫早期发育过程中表达时相的研究[D];中国海洋大学;2010年

9 曾卫军;拟南芥（Arabidopsis thaliana）受胁迫因子诱导激活启动子的筛选及其应用研究[D];华东师范大学;2011年

10 李培英;新疆草坪用野生偃麦草种质资源评价[D];新疆农业大学;2010年

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1 艾方;柑桔—糯米汁混合发酵酒的研制[D];华中农业大学;2010年

2 李福存;发酵鸭血肠生产工艺研究[D];华中农业大学;2010年

3 丁丹华;冷榨油茶籽制备油茶籽粕蛋白及多肽的研究[D];华中农业大学;2010年

4 刘吟;双孢蘑菇采后褐变的相关生理生化变化及其保鲜技术研究[D];华中农业大学;2010年

5 贾炎;镉胁迫下黑麦草对二氧化碳升高的生理生化响应研究[D];华中农业大学;2010年

6 余洋;卤制甲鱼加工工艺及贮藏特性研究[D];华中农业大学;2010年

7 雷莹;柑橘果实化渣性研究[D];华中农业大学;2010年

8 郑芳;茶树接种VA菌根生理生化特性的研究[D];华中农业大学;2010年

9 罗丽;柠檬形克勒克酵母（34-9）对柑橘意大利青霉抑菌机理的研究[D];华中农业大学;2010年

10 蔡东;鄂南棕红壤区施用石灰对桃园土壤和树体营养的效应研究[D];华中农业大学;2010年

【二级参考文献】

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1 姜先荣,杨杰;分子伴侣与蛋白质折叠[J];安徽教育学院学报;2001年03期

2 周南镚;;四季海棠和绿巨人的离体培养及快速繁殖技术[J];安徽农学通报;2007年20期

3 马斌;孙骏威;李素芳;;植物低温诱导蛋白的研究进展[J];安徽农业科学;2010年12期

4 向珣,李成琼,雷建军;热激蛋白与植物抗热性研究进展[J];北方园艺;1999年04期

5 于亚军,代汉萍,李宝江;植物激素和生长调节剂在果树组织培养中的应用[J];北方园艺;2002年06期

6 申晓辉,陆海,王沙生,蒋湘宁,Yill Sung Park ,M.K.Mahedrappa;菠菜胆碱单氧化酶(CMO)基因的克隆及在大肠杆菌中的诱导表达[J];北京林业大学学报;2003年01期

7 王茂良;;植物抗渗透胁迫及其与脯氨酸的关系[J];北京园林;2006年02期

8 肖辉海,陈良碧;温敏雄性核不育水稻几种同工酶的热激反应[J];常德师范学院学报(自然科学版);1999年03期

9 杜建雄;师尚礼;刘金荣;侯向阳;;干旱胁迫和复水对草地早熟禾3个品种生理特性的影响[J];草地学报;2010年01期

10 周鑫,孙凤杰,李亚军;四季海棠的组织培养[J];中国林副特产;2002年02期

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1 秦华;蜡梅（Chimonanthus praecox （L.） Link）冷适应蛋白基因Cpcor413pm1的克隆与功能分析[D];西南大学;2006年

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1 李海燕;秋海棠属花发育及快繁体系的建立[D];东北农业大学;2005年

2 邹丽芳;5种园林绿化草本花卉生态功能的初步研究[D];东北师范大学;2006年

3 潘梅;丽格海棠快繁体系的建立和遗传转化初探[D];西南大学;2007年

4 尹承颖;蒜头果组织培养体系的建立及细胞悬浮培养技术研究[D];四川农业大学;2007年

5 徐美隆;丽格海棠遗传转化及离体诱变体系的研究[D];四川农业大学;2007年

6 许良飞;四季海棠与丽格海棠再生体系的建立[D];四川农业大学;2009年

7 张若纬;黄瓜离体再生和遗传转化体系的建立[D];中国农业科学院;2010年

8 王汝艳;一品红遗传转化体系建立的初步研究[D];扬州大学;2010年

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1 张志宏;赵进春;代红艳;;全基因组基因表达分析技术及其在果树上的应用[J];果树学报;2008年03期

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3 常青山,余增亮;基因表达分析方法及其研究进展[J];生物技术通报;2002年06期

4 占祖兵;张越;赵若苹;王文;;黒腹果蝇中嵌合新基因的进化命运和表达模式[J];动物学研究;2011年06期

5 赵继荣;雒淑珍;张增艳;刘红霞;;cDNA-AFLP技术及其在植物基因表达分析中的应用[J];华北农学报;2009年S1期

6 卢昌;吴国华;颜新敏;赵志荀;李应国;聂福平;张强;;GeXP多重基因表达分析系统及其应用[J];中国兽医科学;2013年02期

7 胡昊;李进进;王彩云;;反转录实时定量PCR在植物基因表达分析上的研究进展[J];中国农学通报;2013年15期

8 陈鹏;汪长东;黄阜峰;汪越胜;杨广笑;何光源;;拟斯卑尔脱山羊草基因的克隆与表达研究[J];生物技术通报;2008年05期

9 赖灯妮;彭克勤;梁雄;长谷川博;;硝酸盐高亲和水稻品种的筛选与硝酸盐高亲和基因表达分析[J];湖南农业大学学报(自然科学版);2009年06期

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1 陈维;;文昌鱼SOX9基因的克隆与分析[A];遗传学与社会可持续发展——2010中国青年遗传学家论坛论文摘要汇编[C];2010年

2 严佳文;袁飞荣;龙桂友;覃磊;邓子牛;;柑橘内参基因的筛选及其表达稳定性分析[A];中国园艺学会2010年学术年会论文摘要集[C];2010年

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1 张晓东;人和大鼠精子发生相关基因的克隆及其基因结构和功能分析[D];中国协和医科大学;2000年

2 童晓玲;家蚕翅模式决定基因的克隆、表达及功能研究[D];西南大学;2008年

3 周纯葆;基因岛预测与隔离迁移模型并行化[D];吉林大学;2012年

4 张桦;新牧1号杂花苜蓿抗逆相关基因的克隆和功能分析[D];新疆农业大学;2011年

5 邓小敏;小麦CBL基因CIPK基因的克隆及在非生物胁迫中的功能研究[D];华中科技大学;2013年

6 陈银华;几种蔬菜ACC氧化酶基因的克隆与鉴定[D];华中农业大学;2005年

7 景孝堂;Ccd1基因发育表达谱和初步功能研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2005年

8 徐宗大;梅花花器官发育相关MADS-box基因的功能分析[D];北京林业大学;2015年

9 杨居祥;大鼠精子发生中阶段差异表达基因的分离、表达及初步功能研究[D];中国协和医科大学;2000年

10 钟其旺;几种鲆鲽鱼类Myostatin基因的克隆及结构和表达分析[D];中国海洋大学;2007年

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1 刘术金;橡胶树胶乳中性/碱性转化酶基因的克隆及其表达特性研究[D];海南大学;2010年

2 李江;基于Disease Ontology的疾病相似性和基因相似性研究[D];哈尔滨医科大学;2011年

3 唐娟;梨蔗糖与磷脂酰胆碱转运蛋白基因的克隆、序列分析及特性研究[D];南京农业大学;2013年

4 王智宇;睾丸新基因的克隆及其在隐睾模型中的表达分析[D];华中科技大学;2008年

5 甘进锋;几丁质酶抑制活性蛋白酶基因和类胡萝卜素结合蛋白基因转家蚕表达研究[D];西南大学;2009年

6 黄彦;利用Lotka-Volterra方程构建小脑组织发育中基因的调控网络[D];重庆医科大学;2007年

7 王俊;个人免费基因检测项目的商业模式案例研究[D];云南大学;2013年

8 张兰男;初发nonM3CN-AML患者EVI1基因高表达提示预后不良[D];华中科技大学;2013年

9 宋绪华;小鼠18S rRNA基因在卵巢和卵母细胞中的表达及其RNAi载体构建[D];山西医科大学;2007年

10 耿微;利用FOX hunting system技术筛选碱茅中与胁迫相关基因[D];东北林业大学;2010年

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