C蛋白引起宿主细胞凋亡的分子机理研究

发布时间：2016-11-11 14:14

  本文关键词：禽呼肠孤病毒Sigma-C蛋白引起宿主细胞凋亡的分子机理研究，由笔耕文化传播整理发布。

《中国农业大学》 2015年

禽呼肠孤病毒Sigma-C蛋白引起宿主细胞凋亡的分子机理研究

张志强  

【摘要】：禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)感染引起家禽的病毒性关节炎、慢性呼吸道症状、生长迟缓和吸收不良综合征等疾病,给家禽养殖业造成重大经济损失。ARV诱导细胞凋亡是造成病毒感染所引起组织损伤的重要诱因,在ARV病毒蛋白中,sigma-C (σC)蛋白被证实能够诱导细胞凋亡,但其诱导凋亡的分子机理尚不明确。 本研究利用流式细胞术检测细胞凋亡,确认过表达ARV σC蛋白能够在DF-1、BHK-21和Hela三种细胞上诱导细胞凋亡。为进一步探寻ARV σC蛋白引起细胞凋亡的分子机理,以aC蛋白作为“诱饵”蛋白,利用酵母双杂交技术从鸡脾脏cDNA文库中寻找与aC蛋白发生相互作用的宿主细胞靶蛋白,并通过β-半乳糖营酶实验加以确认。 为给后续研究提供必要实验工具,以原核表达的aC重组蛋白免疫小鼠,最终得到两株细胞株可以稳定分泌针对aC蛋白高特异性、高亲和力单克隆抗体。Western Blot和间接免疫荧光实验结果表明,所得两株单抗能够特异性识别ARV感染细胞中病毒σC蛋白,为深入研究σC的生物学功能奠定了基础。 基于酵母双杂交筛选的实验结果,进一步证实了候选靶蛋白真核延伸因子1仪亚基1(EEF1A1, eukaryotic elongation factor1alpha1)与细胞凋亡进程相关,利用免疫共沉淀和激光共聚焦两种实验方法证实,ARV σC蛋白与EEF1A1蛋白在宿主细胞中相互作用,并且通过pull down实验分析确定二者相互作用的区域位于aC蛋白C末端210-246位氨基酸残基区域内。 进一步利用RNAi技术沉默DF-1细胞中内源性EEF1A1表达,并以此为基础研究EEF1A1与σC相互作用对σC和ARV诱导细胞凋亡的影响。实验数据表明,EEF1A1表达沉默后,过表达aC蛋白所诱导的细胞凋亡被显著抑制,而ARV所诱导的细胞凋亡被部分抑制。深入研究发现,沉默EEF1A1表达能够抑制σC蛋白和ARV病毒诱导的Caspase-9和Caspase-3活化以及细胞色素C释放,实验结果证实EEF1A1在σC和ARV诱导细胞凋亡中起关键作用。此外,对病毒滴度进行测定发现,沉默EEF1A1表达抑制细胞凋亡有利于ARV在细胞内复制。 本研究揭示了σc蛋白引起宿主细胞凋亡机理,证明aC蛋白与宿主细胞EEF1A1蛋白相互作用诱导细胞凋亡,为进一步揭示ARV感染致病机理、研制新型疫苗以及疫病防控提供参考。

【关键词】：
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【目录】：

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本文编号：171012