猪FcRn介导IgG转运及TGEV感染激活NF-κB信号通路调控FcRn表达的研究

发布时间：2018-04-13 02:12

  本文选题：FcRn + IgG　； 参考：《华中农业大学》2016年博士论文

【摘要】：大约95%以上病原微生物都是通过黏膜途径入侵机体的,因此黏膜免疫日益受到人们的重视。一般认为黏膜免疫主要是通过多聚免疫球蛋白受体(polymeric immunoglobulin receptor,pIgR)介导IgA转运到黏膜表面发挥作用。研究发现,在黏膜分泌物中也存在一定量的IgG,并在黏膜表面保护机体防止病原入侵的过程中起到重要作用。而IgG转运到黏膜表面主要是通过新生儿Fc受体(neonatal Fc receptor,FcRn)介导的。目前大量的研究主要集中在对人和小鼠的FcRn功能及表达调控方面的研究,但是对于猪源的FcRn功能的研究比较少,同时国内外尚未见到有关病原感染对FcRn表达调控方面的研究。因此,本研究拟应用猪小肠上皮细胞系(IPEC-J2)构建体外胞转模型,研究猪FcRn介导IgG的转运功能;同时研究猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)感染IPEC-J2细胞激活NF-κB信号通路对FcRn的表达调控。取得的主要研究结果如下:1.猪小肠上皮细胞FcRn的表达及分布根据已经报道的猪FcRnα链基因序列设计特异性引物,以IPEC-J2细胞的总RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增获得了FcRnα链基因片段。经Western blot检测发现FcRn蛋白在IPEC-J2细胞系上的表达。进一步通过间接免疫荧光检测发现FcRn主要分布在极化的IPEC-J2细胞的顶膜侧;仔猪空肠组织切片检测结果也显示FcRn主要分布在小肠绒毛上皮细胞的顶膜侧。2.猪FcRn介导IgG双向胞转作用的研究以IPEC-J2细胞构建体外胞转模型,将生物素标记的猪IgG(biotin-IgG)加入到胞转模型,进行Western blot检测。结果发现极化的IPEC-J2细胞在37°C可以双向转运IgG,在4°C不能转运IgG。以上结果证明IgG是跨细胞途径转运穿过上皮细胞屏障。为了进一步研究IgG跨极化上皮细胞双向转运是由FcRn特异性介导的,在biotin-IgG胞转过程中加入protein A或未标记的IgG作为抑制剂。结果显示在加入protein A或未标记的IgG后,明显抑制了IgG双向转运。激光共聚焦显微镜结果也证明了FcRn可以与IgG在细胞内结合并介导Ig G跨上皮细胞转运。运用免疫共沉淀的方法证明了FcRn与IgG结合是pH依赖的,即在酸性条件下pH6.5,FcRn与IgG结合,在中性偏碱性条件下pH7.0,FcRn与IgG不结合。由于FcRn可以介导IgG的转运,因此,在胞转模型中,以TGEV为模式病原,将抗TGEV特异性IgG加入到细胞底侧小室,在极化的IPEC-J2细胞顶侧小室加入0.1 MOI TGEV病毒液。结果发现FcRn转运特异性IgG能够中和病毒。以上结果说明Fc Rn介导IgG转运穿过黏膜屏障,在保护机体防止病原通过黏膜表面入侵的过程中起到重要作用。3.TGEV感染IPEC-J2细胞激活NF-κB信号通路对FcRn表达调控的研究NF-κB是一个广泛表达的转录因子,主要涉及与免疫应答、炎症反应、细胞分化相关的基因转录。本研究发现TGEV感染IPEC-J2细胞能够激活NF-κB信号通路。首先,运用NF-κB荧光素酶报告系统检测TGEV感染IPEC-J2细胞对NF-κB的激活情况,结果发现能显著增强NF-κB荧光素酶活性。进一步通过pEGFP-p65质粒转染IPEC-J2细胞,在TGEV感染后,激光共聚焦显微镜结果显示p65转位入核。TGEV感染IPEC-J2细胞,通过荧光定量PCR和Western blot方法检测发现能显著上调FcRn的表达。经在线软件分析FcRn启动子转录因子结合位点,发现除了具有NF-κB转录因子结合位点还有MAPK下游的转录因子结合位点,因此为了确定NF-κB和MAPK在FcRn上调表达中的作用,应用NF-κB抑制剂和MAPK相关抑制剂处理细胞,结果发现NF-κB抑制剂处理的细胞能显著抑制TGEV诱导的FcRn表达,而MAPK抑制剂处理的细胞不影响TGEV诱导的FcRn表达。说明FcRn的上调表达与NF-κB信号通路密切相关。进一步根据在线软件预测转录因子结合位点将FcRn启动子区域不断截短,最终构建了9个不同长度的FcRn启动子荧光素酶报告质粒,经荧光素酶活性检测发现FcRn启动子区NF-κB主要结合位点位于上游的-1381~-208之间。最后应用染色质免疫共沉淀(CHIP)和凝胶迁移实验(EMSA)证明这个区域具有4个p65转录因子结合位点。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.28

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本文编号：1742468