苋菜甜菜红素合成的生理生化与分子生物学研究

发布时间：2018-04-16 01:17

  本文选题：苋菜 + 甜菜红素　； 参考：《福建农林大学》2016年博士论文

【摘要】：甜菜红素是一种吲哚来源的天然植物色素,具有抗氧化、抗癌等生理功能,广泛存在于不含花青素的部分石竹目部分植物中。苋菜富含甜菜红素,有取代甜菜作为甜菜红素主要来源的趋势。尽管参与甜菜红素合成途径中一些关键基因和多数关键酶已经在甜菜等作物中被发现,但甜菜色素合成机制仍未被完全揭示,而且苋菜中参与甜菜红素合成的关键基因和关键酶也大多未见报道。因此,研究苋菜甜菜红素合成机制可以进一步完善甜菜红素代谢通路,也为更好利用苋菜资源提供理论依据。本文以叶用苋菜为材料,进行了甜菜红素合成途径关键基因的克隆,克隆到3条糖基转移酶基因、1条AmaTyDC基因和1条AmaDODA基因的cDNA序列和gDNA序列,并克隆了AmaB5-GT和AmaDOPA5-GT基因的启动子序列。研究了这些基因在苋菜不同品种间、不同组织部位及在植物生长调节剂和不同光质处理后的表达情况,并进一步分析了这些基因的表达与苋菜中甜菜红素含量的关系。以红苋品种‘大红’苋菜为材料,对叶片的红色部分和绿色部分进行转录组测序,揭示影响甜菜红素合成的相关代谢网络及可能的影响因素,结合红色叶片和绿色叶片的生理生化指标系统地分析了苋菜叶片红绿部分呈色的分子机理。1苋菜甜菜红素合成相关基因及启动子克隆与分析利用RT-PCR和RACE技术成功从‘大红’苋菜中克隆了3条糖基转移酶基因：AmaDOPA5-GT(GenBank登录号为：kp174811,长度为1,700 bp)、AmaB6-GT(GenBank登录号为：kp174812,长度为1,674 bp)、AmaB5-GT(GenBank登录号为：kp174810,长度为1,666 bp),1条多巴脱羧酶基因AmaTyDC (GenBank登录号为：Kp165397,长度为1,669bp)和1条双加氧酶基因AmaDODA(GenBank登录号为：kp165399,长度为1,085 bp) cDNA序列。并获得了这5条基因的gDNA序列,其中只有AmaDODA具有2个内含子,其它4条不具有内含子。并进一步对AmaDOPA5-GT和AmaB5-GT基因的启动子序列进行了克隆,通过对其顺式作用元件分析发现,它们均含有丰富的响应光、激素、厌氧、干旱及其它胁迫顺式作用元件以及MYB转录因子结合位点,推测这两个基因的表达可能受光、激素、逆境胁迫以及MYB转录因子的调控。2苋菜甜菜色素含量与合成相关基因表达水平的关联分析2.1不同苋菜品种、不同组织部位中甜菜红素含量和合成相关基因的表达情况研究不同苋菜品种中甜菜红素含量差异较大,全红苋菜甜菜红素含量最高,绿苋中含量较少。实时定量PCR结果表明,AmaB6-GT, AmaB5-GT, AmaDOPA5-GT和AmaTyDC四条基因均在红苋菜中表达量最高,AmaTyDC和AmaB6-GT在各苋菜品种中的表达量与它们含有的甜菜红素趋势一致,推测它们直接参与甜菜红素合成的调控；AmaDODA基因在四个苋菜品种中的表达量差异不大,这可能与其参与其它代谢有关。进一步对AmaB5-GT, AmaB6-GT, AmaDOPA5-GT在‘大红’苋菜各组织器官中的表达分析,结果表明它们分别在叶柄、叶、根和绿叶部分表达量最高,这与甜菜红素含量：红色叶片绿色叶片红茎根绿茎和叶柄含量的差异趋势不一致。2.2不同激素处理对苋菜甜菜红素累积与相关基因表达量的影响细胞分裂素(KT和6-BA)处理可提高苋菜幼苗中甜菜红素含量。其中KT通过诱导糖基转移酶基因的表达而提高苋菜幼苗中甜菜红素的含量；而6-BA促进AmaDODA和AmaB5-GT的表达,6-BA通过提高多巴双加氧酶的活性,增加了AmaDOPA5-GT和AmaB5-GT可以催化生成苋菜苷的底物,从而促进了苋菜中甜菜红素的累积。而外源GA3和2,4-D抑制色素的累积。2,4-D处理的幼苗中,AmaB5-GT, AmaTyDC和AmaB6-GT的表达量与色素含量一致的降低。GA3具有转移甜菜红素合成前体物的作用,所以其它相关合成的基因表达水平高并不能使苋菜中累积较多的甜菜红素。2.3不同光质处理对苋菜甜菜红素累积与相关基因表达量的影响对不同光质处理条件下苋菜幼苗中甜菜红素含量的变化的研究表明短波长光质(蓝光)有利于色素的累积,这与苋菜幼苗中AmaTyDC, AmaB5-GT和AmaDOPA5-GT三个基因的表达量一致,说明这3个基因表达对甜菜红素的合成影响较大。然而这3个基因与AmaDODA在红光照射下表达量也较高,可能与苋菜幼苗中苋菜苷含量减少引起的反馈调节有关。3甜菜红素分布及甜菜红素含量不同的苋菜品种、组织部位生理生化指标差异研究3.1甜菜红素分布和淀粉含量研究徒手切片法对甜菜红素在‘大红’苋菜和‘白圆叶’苋菜不同组织部位的分布情况的研究表明：甜菜红素在‘大红’苋菜中主要分布在叶片背面靠近叶脉的表皮细胞及各组织部位的维管束周围的鞘细胞中,在‘白圆叶’苋菜的各组织部位观察不到甜菜红素的存在。另外,在‘白圆叶’苋菜的叶片中淀粉粒数量明显多于‘大红’苋菜,同时在‘大红’苋菜中仅在靠近叶脉部位发现较多的淀粉粒。3.2红叶和绿叶部分光合速率、抗氧化能力、叶绿素荧光差异研究分别测定了‘大红’苋菜红叶部分和绿叶部分的光合速率。发现‘大红’苋菜叶片红色部分净光合速率明显低于绿色部分。研究了‘大红’苋菜红叶和绿叶部分抗氧化能力差异,发现‘大红’苋菜红色部分比绿色部分具有更高的SOD酶活性和总抗氧化能力。说明了甜菜红素具有清除植物体内羟自由基和活性氧的能力。研究了室温条件(25℃)和高温处理(40℃)下,‘大红’苋菜红叶和绿叶部分叶绿素荧光差异情况,发现在室温条件(25℃)下,绿叶部分光合能力明显高于红叶部分,而在高温(40℃)处理后,苋菜叶片红色部分光合能力的降低水平明显低于绿叶部分,说明甜菜红素对苋菜具抗热胁迫作用。4苋菜叶片红色部分和绿色部分转录组差异分析利用RNA-Seq技术比较分析了‘大红’苋菜叶片红色部分和绿色部分转录组差异,获得80,026条苋菜Unigene,其中2,178条unigene(1,320条上调,858条下调)在红绿叶样品间表达差异显著。对这些差异表达基因进行功能归类分析发现：这些基因主要涉及次级代谢、植物激素信号传导、光合作用、淀粉和糖代谢等途径。这些基因的差异表达在一定程度上验证了我们在前期获得的结果。本研究还发现类黄酮代谢相关基因在红色叶片中下调显著,这印证了甜菜红素合成和类黄酮在植物中的竞争关系,也可以在一定程度上解释甜菜红素和花青素“不共存”现象。另外,一些MYB转录因子家族基因在红绿叶部分差异表达极显著,其中有三个在红叶部分极显著上调的MYB基因与甜菜BvMYB1基因同源性较高,推测它们可能在调控苋菜甜菜红素合成过程中发挥着重要作用。本研究还发现了大量的未知功能的差异表达基因,说明苋菜中甜菜红素代谢的调控可能还有很多不明之处,仍需进一步研究。
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【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S636.4
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本文编号：1756664