水貂肠炎细小病毒致病株的分离及VP2蛋白部分关键氨基酸位点的功能研究

发布时间：2018-04-18 02:41

  本文选题：水貂肠炎细小病毒 + VP2蛋白　； 参考：《中国农业大学》2016年博士论文

【摘要】：水貂病毒性肠炎是由水貂肠炎细小病毒(Mink enteritis parvovirus, MEV)引起的,以剧烈腹泻为主要临床特症的急性、传染性疫病,该病传播速度快,幼貂致死率达80%,常对养貂业造成巨大的经济损失。MEV作为猫细小病毒(Feline parvovirus, FPV)的变种,属于细小病毒科,细小病毒属成员,基因组为单股负链DNA,包含两个ORF,左端ORF编码非结构蛋白NS1和NS2,右端ORF编码结构蛋白VPl和VP2。NS1蛋白是多功能蛋白,调控病毒基因组复制和转录。VP2蛋白是主要的衣壳蛋白,含有关键功能位点,参与调控病毒复制、血凝性、抗原性、宿主范围和致病性；VP2蛋白还能自我组装形成空衣壳。本课题主要对MEV VP2蛋白中参与调控病毒复制和宿主范围的关键氨基酸位点进行研究。首先,从发病水貂粪便样品中分离出一株MEV毒株,通过PCR鉴定、F81细胞分离培养、电镜观察、血凝和血凝抑制、间接免疫荧光(IFA)和动物感染等实验方法,证明分离株为一株MEV致病株,命名为MEV-LHV。IFA结果表明,致病株MEV-LHV的感染效率比本实验室已分离的弱毒株MEV-L高。MEV-LHV和MEV-L的多步生长曲线结果表明,致病株MEV-LHV具有更强的复制能力,其最高滴度是弱毒株MEV-L的10倍。PCR扩增获得了包括两端发夹结构序列的MEV-LHV全基因组序列,并对发夹结构及其功能元件进行了预测。将MEV-LHV和MEV-L的全基因组序列与GenBank上的其它6株全基因组序列进行了同源比对分析和进化树分析,更全面的了解了MEV全基因组特征和进化特性,推测了可能与病毒复制和致病性相关的位点。上述研究中发现致病株比弱毒株具有更高的复制能力和致病性。为了探究VP2蛋白上可能与病毒复制和致病性有关的氨基酸,对GenBank中20株MEV毒株(包括MEV-LHV和MEV-L)的VP2序列进行了分析,发现强弱毒株间有3个氨基酸位点存在差异,即101、232和411。以本实验室已构建的MEV-L全基因组感染性克隆pMEV-L为模板,利用PCR介导的定点突变技术,分别将101 Ile、232 Ile和411 Ala突变成强毒株的相应氨基酸101 Thr、232 Val和411 Glu,除了3个单位点突变的感染性克隆,还构建了3个位点都突变的感染性克隆。共4个全基因组感染性克隆转染F81细胞,经细胞病变、IFA等鉴定,证实4个突变体病毒拯救成功。各位点突变不影响病毒对宿主细胞的结合及进入能力。病毒VP2基因转录和蛋白表达水平、多步生长曲线、蚀斑实验和单次感染周期内病毒基因组DNA复制的检测等结果表明,101和411位氨基酸突变能够提高病毒的复制效率,但依然比致病株MEV-LHV的复制效率低；232位氨基酸的突变则降低了病毒的转录和复制效率,三突变体病毒(MEV-L I101T/I232V/A411E)的转录和复制水平最低；MEV-LHV与MEV-L转录水平无差异,但MEV-LHV的VP2蛋白表达水平更高,具有更高效的复制效率。对感染性病毒粒子的产生进行检测,结果表明,与亲本毒MEV-L相比,MEV-L I101T和MEV-L A411E不影响感染性病毒粒子的产生；而232位突变(MEV-L I232V和MEV-L I101T/I232V/A411E)则降低了感染性病毒粒子的产生；致病株MEV-LHV产生较高滴度的感染性病毒粒子。突变毒株分别接种水貂,并未产生明显临床症状,结果表明,这3个位点并不是致病力的决定因子。病毒与宿主细胞的识别与结合对病毒的致病性发挥关键作用。MEV不能感染犬肾细胞MDCK,而能感染表达猫源转铁蛋白受体(TfR)的MDCK细胞,证明MEV可以利用猫TfR作为受体感染细胞。MEV和犬细小病毒(Canine parvovirus, CPV)是FPV的宿主变异株,对两者的VP2蛋白氨基酸序列进行比对分析,发现6个差异的氨基酸位点80、93、103、323、564、568。将MEV-L的这6个氨基酸突变成CPV的相应氨基酸,构建了6个单位点突变的感染性克隆,以及93、323同时突变和80、564和568同时突变的2个感染性克隆。将上述8个感染性克隆分别转染F81细胞,经细胞病变、IFA等鉴定,证实8个突变体病毒拯救成功。将MEV 93 Lys和323Asp分别突变成CPV的93 Asn和323 Asn,能够使MEV感染MDCK,两位点同时突变则感染效率更高,证明了93、323位氨基酸突变可使其宿主范围扩大至犬细胞,且其突变不影响病毒与F81细胞受体的结合及细胞内病毒的复制能力。将MEV80Lys、564 Asn和568 Ala分别突变为CPV的80Arg、564 Ser和568 Gly,不影响病毒与细胞的结合能力,但3位点同时突变,则降低了病毒与F81细胞的结合效率,说明80、564、568位氨基酸同时突变,在一定程度上影响了病毒与宿主细胞受体的相互作用,但并不能抑制病毒感染F81细胞。80、564和568位氨基酸的单突变体或三突变体病毒均降低了病毒的复制效率。MEV V103A氨基酸突变对病毒的宿主范围和复制效率无显著影响。目前,随着新的细小病毒的发现,细小病毒宿主范围不断扩大。以上结果将有利于更全面的了解病毒的全基因组特征和生物学特征,为病毒复制、宿主范围和致病性的深入研究奠定基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 郭兰萍;苏兆众;罗祖玉;陈涛生;栾颖;蒲小红;;恶性转化增加细胞对细小病毒的敏感性[J];细胞生物学杂志;1988年03期

2 李发志,叶钟灼;兔细小病毒肺炎的诊断与防治[J];四川动物;1990年01期

3 Anderson L;赵洪礼;;人类细小病毒[J];国外医学(微生物学分册);1991年04期

4 刘明慧;石践;单振振;袁宝;任文陟;;猫细小病毒的分离与鉴定[J];吉林畜牧兽医;2008年10期

5 汪晓郓;时坤;刁燕;尹茉莉;冯海峰;杜锐;;鹿源细小病毒的分离与鉴定[J];经济动物学报;2009年01期

6 靳小霞;孙兆增;曾林;王化磊;王铁成;杨松涛;夏咸柱;;猴源细小病毒血凝和血凝抑制试验的优化与应用[J];中国实验动物学报;2011年06期

7 刘碧涛;任常宝;张晓战;许冬蕾;郑良焰;唐兆新;;猫细小病毒的分离与鉴定[J];动物医学进展;2013年09期

8 苏兆众;罗祖玉;;哺乳动物及人自主性细小病毒研究概况[J];国外医学(微生物学分册);1987年03期

9 苏兆众,罗祖玉,郭兰萍;用细小病毒-人细胞系统检测低剂量基因毒物的致突性[J];科学通报;1988年01期

10 罗祖玉,王顺德,王健,刘为平;细小病毒核苷酸序列同源性的比较——对抗癌作用的一点启示[J];复旦学报(自然科学版);1990年04期

相关会议论文 前10条

1 杨松涛;王淑君;冯浩;张仁舟;曾林;夏志平;邹啸环;王承宇;连海;孙兆增;孟轲音;王泽;夏咸柱;;猴源细小病毒的分离鉴定[A];中国畜牧兽医学会小动物医学分会第四次学术研讨会、中国畜牧兽医学会兽医外科学分会第十六次学术研讨会论文集（1）[C];2009年

2 杨松涛;王淑君;冯浩;张仁舟;曾林;夏志平;邹啸环;王承宇;连海;孙兆增;孟轲音;王泽;夏咸柱;;猴源细小病毒的分离鉴定[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会论文集（下册）[C];2009年

3 杨松涛;乔军;谢之景;赵忠鹏;戈锐;王铁成;冯娜;夏咸柱;;肉食兽细小病毒研究概述[A];全国兽医外科学第13次学术研讨会、小动物医学第1次学术研讨会暨奶牛疾病第3次学术讨论会论文集[C];2006年

4 闫喜军;张海玲;陈涛;柴秀丽;赵建军;罗国良;吴威;邵西群;;肉食兽细小病毒分子流行病学研究[A];首届中国兽药大会——兽医生物制品学、兽医微生物学学术论坛论文集（2008）[C];2008年

5 卢悦;王贵升;田夫林;;水貂细小病毒检测技术研究进展[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会论文集[C];2013年

6 谢之景;夏咸柱;扈荣良;叶俊华;黄耕;徐黎;赵忠鹏;马长书;徐玉生;;犬细小病毒基因型的调查研究[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集（下）[C];2003年

7 张云;胡奇林;童光志;相文华;;鹅和番鸭细小病毒全基因克隆与序列分析[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会成立大会暨第一次学术研讨会论文集[C];2008年

8 闫喜军;张海玲;陈涛;柴秀丽;赵建军;罗国良;吴威;王凤雪;邵西群;;水貂肠炎细小病毒分子流行病学研究[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会论文集[C];2008年

9 谢丽基;谢芝勋;邓显文;谢志勤;庞耀珊;范晴;刘加波;;鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒二重荧光定量RT-PCR方法的建立[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十六次学术研讨会论文集[C];2012年

10 陈春花;邓同炜;李文刚;张桂云;;鸽子疑似细小病毒的诊断[A];中国畜牧兽医学会禽病学会分会第十次学术研讨会论文集[C];2000年

相关重要报纸文章 前3条

1 本报记者 李婵;贩狗陷阱藏疾患风险[N];北京科技报;2011年

2 ;夏季幼貂该如何管理[N];吉林农村报;2008年

3 王华;仔貂的前期管理[N];瓜果蔬菜报.农业信息周刊;2007年

相关博士学位论文 前3条

1 毛亚萍;水貂肠炎细小病毒致病株的分离及VP2蛋白部分关键氨基酸位点的功能研究[D];中国农业大学;2016年

2 李雪梅;鹅细小病毒和番鸭细小病毒部分基因组克隆、序列分析及VP2-VP3基因的表达[D];中国人民解放军军需大学;2001年

3 布日额;GPV VP及NS基因克隆及其原核表达产物的研究和应用[D];东北农业大学;2005年

相关硕士学位论文 前10条

1 靳小霞;猴源细小病毒的人工感染及免疫预防研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2011年

2 梁萌;大熊猫源细小病毒的分离鉴定与遗传进化分析[D];吉林大学;2013年

3 杨洋;肉食动物细小病毒重组疫苗研究[D];吉林大学;2013年

4 丁毅;猫细小病毒灭活疫苗的制备及保护性研究[D];吉林大学;2010年

5 李亚莎;人血样中细小病毒的检测与分析：肿瘤患者人群具有高感染率[D];华中师范大学;2011年

6 雍海平;猫细小病毒间接ELISA方法的建立及灭活疫苗毒株筛选[D];吉林大学;2008年

7 贺亦龙;5株水禽细小病毒基因组的克隆与遗传进化分析[D];东北农业大学;2014年

8 左静;水貂肠炎细小病毒抗原性分析及其特异性马源抗体的制备[D];吉林大学;2011年

9 张习本;黄芪多糖对犬感染细小病毒血常规变化与脂质过氧化的影响及疗效研究[D];贵州大学;2008年

10 王建科;抗水貂肠炎细小病毒单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的建立[D];中国农业科学院;2009年

，

本文编号：1766457