新型家蝇抗菌肽基因MDAP-2的表达、生物学活性及抗菌机制研究

发布时间：2018-05-02 14:00

  本文选题：家蝇 + 抗菌肽　； 参考：《吉林农业大学》2016年博士论文

【摘要】：近年来,随着抗生素在疾病防治、卫生保健品及动物饲料等方面的不规范使用,导致一些抗药的超级细菌、病毒不断涌现,抗生素的使用效果逐年下降,给疾病防治带来了极大困难。因此,寻找新型、安全、高效的抗菌制剂代替传统的抗生素,已成为当前甚至未来几十年国内外抗菌药物研究的热点。抗菌肽是生物体内产生的一类具有较强抗细菌、真菌、病毒、寄生虫、支原体、慢病毒乃至肿瘤细胞活性的小分子多肽,以具有较低免疫原性、抗菌谱广、毒副作用小和不易使细菌产生耐药性而著称,备受国内外学者关注。家蝇幼虫体内外常携带多种病原菌,并能向人、家畜和家禽传播多种疾病,而本身却很少发病,即使在高密度、大规模的人工养殖条件下,也极少出现集体发病的现象,其独特的抗病能力与其体内产生的多种抗菌肽有关。家蝇抗菌肽种类多、抗菌谱广、抗菌作用独特,具有传统抗菌药物无可比拟的优点,因此,家蝇抗菌肽有可能成为新一代的抗菌制剂,在一定程度上部分代替抗生素,并有效遏制细菌耐药性的蔓延。本研究在以鸡源沙门氏菌诱导家蝇幼虫构建的抑制性消减文库(SSH)的基础上,采用RACE技术获得了一条大小为198bp的抗菌肽基因,命名为MDAP-2,并对该基因进行了克隆和生物学功能预测,结果显示其结构独特,与Genbank中收录的所有基因的核苷酸序列均无同源性,推断其可能是一个新的基因,基因序列已上传Genbank,登录号为KJ787648。生物信息学软件预测结果显示:MDAP-2的分子量为7.785Kda;理论等电点为10.61;亲水性较强,最大值达2.811;二级结构以α 螺旋为主。为了进一步确定MDAP-2的主要生物学功能,本研究将该基因与载体pET-32a(+)连接构建重组表达质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了表达,然后采用镍亲和层析柱对其表达产物进行了纯化,并对纯化产物的抗菌活性进行检测,发现MDAP-2对临床分离的部分G-菌(猪源大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌耐药株、牛巴氏杆菌)有抑制作用,对鸡源沙门氏菌的抑菌环直径可达25mm,但对受检的G+菌无抑制作用,该特性与以往发现的抗菌肽有所不同,结合其核苷酸/氨基酸序列的独特性,推测其可能是一个新的家蝇抗菌肽,并存在特殊的生物学活性和杀菌机制。为了研究MDAP-2的生物学活性,本研究采用圆二光谱技术对其在溶液中的二级结构进行了研究,并检测了其对家兔红细胞的溶血性、在Babl/c小鼠体内的生物安全性进行检测。二级结构检测结果显示,抗菌肽MDAP-2在5mM PBS溶液中(模拟水环境)和含有50%TFE及30mM SDS的PBS溶液中(模拟细胞膜结构)均在190nm和200nm处有很强的正吸收峰,在208nm、222nm处有很强的负吸收峰,表明MDAP-2二级结构中以α-螺旋为主,并存在少量β 折叠结构,与生物信息学预测结果基本吻合。体外溶血活性检测结果显示,当抗菌肽MDAP-2浓度达到1600μg/ml时,溶血率仅为6.6%,低于文献报道中的猪乳铁蛋白肽LFP-20(256μg/ml)和八肽菌素(320μg/ml),由此可见MDAP-2具有较低的体外溶血活性,对哺乳动物细胞毒性很低。采用小鼠尾静脉单次给药的方法检测了抗菌肽MDAP-2对小鼠的急性毒性,LD50为37.564 mg/kg,95%的可信限为34.537和42.813mg/kg,其毒性低于报道中的多种抗菌肽,表明抗菌肽MDAP-2对小鼠具有较低的毒性。为了研究MDAP-2的抗菌机制,本研究采用荧光探针技术、透射电子显微镜技术及流式细胞术等试验方法研究了抗菌肽MDAP-2对鸡沙门菌生长曲线的影响,对细菌微观结构的影响,对细菌细胞膜的通透性、完整性的影响,对细菌细胞质膜的去极化能力及其DNA结合能力进行了检测。结果表明,MDAP-2对鸡沙门氏菌的生长具有明显的抑制作用,在MDAP-2浓度为0.24mM时即能杀灭细菌;透射电镜图片显示,MDAP-2能使鸡沙门氏菌的细胞膜严重变形、破损,内容物外泄,导致细菌死亡;β-半乳糖苷酶检测试验结果显示,MDAP-2能够使细菌细胞膜的通透性增加,把β-半乳糖苷酶释放到细胞外,分解ONPG,使得反应体系中A405nm的OD值升高;采用DiBAC4(3)膜电位敏感性探针对抗菌肽作用过的鸡沙门菌细胞进行染色,于流式细胞仪上检测其荧光强度变化,其荧光强度明显增加,可达35.9%,可见MDAP-2可使细菌细胞质膜去极化,导致细菌膜内外电势差增加,进而导致细菌死亡;采用PI对抗菌肽MDAP-2作用过的鸡沙门菌细胞进行染色,于流式细胞仪上检测其荧光强度变化,结果显示抗菌肽处理组的细菌细胞内的荧光强度明显增加,可达66.5%。说明抗菌肽MDAP-2能破坏细菌细胞膜的完整性,使细胞内离子外流,水分子内流,导致细菌死亡;MDAP-2能够抑制质粒DNA的电泳迁移率,使电泳速度变慢,证明抗菌肽MDAP-2具有DNA结合能力,可能通过进入细菌细胞内,阻碍DNA复制来发挥抗菌作用。
[Abstract]:In recent years , with the use of antibiotics in the prevention and control of diseases , health care products and animal feed , it is very difficult to find novel , safe and efficient antibiotic preparation . 浜叉按鎬ц緝寮，

本文编号：1834201