传染性鲑鱼贫血症病毒M1蛋白的结构与功能研究

发布时间：2018-05-14 16:52

  本文选题：正粘病毒 + 传染性鲑鱼贫血症病毒　； 参考：《华中农业大学》2017年博士论文

【摘要】：许多囊膜病毒都能够编码基质蛋白,包括副粘病毒、正粘病毒、疱疹病毒、逆转录病毒和脊髓灰质炎病毒。病毒的基质蛋白也被称为病毒装配 适配器‖,因为它能介导病毒包膜或糖蛋白与病毒核糖核蛋白(RNP)复合物的相互作用,从而促进病毒基因组组装进新装配的病毒中。正粘病毒家族所有的成员,包括流感病毒A、B、C、索戈托病毒属,以及Isavirus,都编码基质蛋白,并称为M1。在A型流感病毒中,基质蛋白1(M1)在病毒的囊膜下聚集成一层蛋白层,帮助形成感染病毒的形状以及维持其结构的完整性。研究表明,流感病毒的M1蛋白能介导核衣壳的核输出以及随后将其包装到新的病毒粒子中,还能够介导病毒的出芽。尽管对于A型流感病毒M1蛋白的研究十分广泛及细致,但到目前为止,只有其N端结构域的晶体结构被解析出来。传染性鲑鱼贫血症病毒(ISAV)是一种能够导致养殖的大西洋鲑鱼高死亡率的重要的正粘病毒。ISAV和流感在病毒结构、基因组成、生活周期以及病毒编码的各种蛋白的功能上都有很多相似之处,是研究流感病毒蛋白的结构与功能的一个很好的可供选择的模型。为了从整体上更好地了解正粘病毒M1蛋白的结构和功能,本研究解析了ISAV的M1蛋白(ISAV-M1)全长的晶体结构,分辨率达到了2.6?。这是国内外首次报道正粘病毒基质蛋白的全长晶体结构。ISAV-M1的晶体结构表明:其含有一个N端结构域(N-domain)和C端结构域(C-domain),整体呈现一个肘形。虽然ISAV-M1的N-domain与A型流感病毒M1蛋白的N-domain在序列上相似度很低,但其在结构上却是相似的。ISAV-M1的C-domain通过一个延伸的Loop结构与N-domain相连,并且折叠成一个含有4个α-螺旋的螺旋束。在晶体中,ISAV-M1的单体组装成无限的二维晶格,这种结构特征与流感病毒完整的病毒颗粒中与膜相连的基质蛋白的结构类似。通过脂质体浮选实验,发现ISAV-M1是通过静电相互作用与膜结合的,并且找出了关键的膜结合位点是在N-domain上的K63/K66/K68。同时也证实ISAV-M1具有RNA结合活性。此外,用低温电子断层扫面检测ISA病毒粒子,发现ISAV-M1在病毒的包膜下面形成一层蛋白基质。将ISAV-M1的二维晶格拟合到断层扫描图片中,能够很好地与基质蛋白层的密度厚度相吻合,这说明本研究的二维M1晶格很好地模拟了真实状态下感染颗粒中的基质蛋白层。有研究表明,ISAV的NS1和M2都是I型干扰素拮抗剂。而对于M1或NEP的特性认识却非常少。此外,之前的研究称热休克同源蛋白70(Hsc70)能够与流感病毒的M1和NEP蛋白相互作用,为病毒的核糖核蛋白(vRNP)通过vRNP-M1-NEP复合物的输出提供帮助。因此,本研究检测了在单独表达或共表达的情况下,ISAV的M1、NEP蛋白以及Hsc70蛋白的细胞亚定位情况。同时,这三个蛋白的相互作用也用pull-down实验进行了验证。本研究的目的是阐明ISAV的M1蛋白和NEP蛋白以及细胞的Hsc70的亚细胞定位以及相互作用。结果表明:当M1、NEP以及Hsc70蛋白单独表达在杂交鳢(SSN-1)细胞中时,发现M1是同时定位在细胞质和细胞核中的,NEP则是只定位在细胞质中并且在细胞核周围聚集,而Hsc70是遍布在细胞质中且细胞核中没有。当这三个蛋白两两共表达时,我们发现M1和Hsc70都分别能够与NEP共定位在细胞质中并聚集在细胞核周围。而M1和Hsc70共表达时,其定位情况与单独表达时类似。与此同时,本研究还进行了pull-down实验来验证三个蛋白之间的相互作用。结果表明,NEP能够分别与M1和Hsc70相互作用,而M1和Hsc70之间的相互作用也能观察到,但是相对于NEP与Hsc70之间的相互作用要弱很多。本研究阐明了ISAV的M1和NEP蛋白以及Hsc70的亚细胞定位和相互作用。这些数据将会帮助我们对于ISAV的生命周期尤其是vRNP的输出过程有一个更好的理解。
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本文编号：1888710