核型多角体病毒诱导棉铃虫幼虫上爬行为的分子机制研究

发布时间：2018-05-24 08:30

  本文选题：棉铃虫 + 上爬行为　； 参考：《中国农业大学》2017年博士论文

【摘要】：许多寄生物通过操纵寄主行为改变来促进自身的繁殖和传播。鳞翅目幼虫感染杆状病毒以后上爬到寄主植物的顶部,最后倒挂死亡和液化,并释放出病毒粒子。杆状病毒的这种行为操纵被描述为"tree-top disease"或者"Wipfelkrankheit"。近些年来,杆状病毒诱导的寄主上爬行为被证明受到杆状病毒egf基因/EGT蛋白和光照的调控。然而,目前关于寄主体内的哪些基因或者miRNAs参与调控杆状病毒诱导的寄主上爬行为还不清楚。本研究主要运用高通量测序和RNAi的方法鉴定了棉铃虫(Helicoverpa armigera)体内的一些信号通路以及它们在棉铃虫核型多角体病毒(H.armigera singlenucleopolyhedrovirus,HaSNPV)诱导的上爬行为中的相关作用。研究结果主要包括以下5个方面。(1)首先,验证了 3种不同试验条件(温室棉花、温室棉绳和实验室玻璃管)下HaSNPV诱导的棉铃虫上爬行为。结果表明,3种试验条件下染毒棉铃虫幼虫均在较高的位置死亡,这也说明HaSNPV诱导的棉铃虫上爬行为是寄主自身固有的特性,和试验设置无关。同时,染毒幼虫的死亡高度随着病毒浓度的增加而升高。(2)高通量测序结果表明棉铃虫幼虫感染HaSNPV后72 h,脂肪体内有5972个基因发生了差异表达,它们主要属于20个信号通路,包括蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)和保幼激素(Juvenile hormone,JH)信号通路、免疫和压力反应信号通路、脂肪酸代谢通路等。同时,HaSNPV感染显著地抑制棉铃虫20E信号,而促进JH信号通路。最后,利用qRT-PCR验证了随机挑选的20个差异表达基因,这些差异基因的表达趋势和转录组测序结果基本一致,只是差异表达的倍数有一些变化。(3)外源激素处理和RNAi试验证明了 20E信号通路通过影响HaSNPV复制、OB产物和染毒幼虫的死亡高度负调控HaSNPV诱导的棉铃虫上爬行为,而JH信号通过拮抗20E信号的作用促进棉铃虫的上爬行为。20E和JH信号通路的下游关键基因BrZ2被成功地干涉掉以后,HaSNPV复制和OB产物和对照组相比均显著地增加,而染毒幼虫的LT50明显缩短,死亡高度显著升高。(4)miRNAs微芯片测序结果表明棉铃虫感染HaSNPV后脂肪体内有127个差异表达的寄主miRNAs。通过2个靶标预测软件预测到miR-8和miR-429可能和BrZ2的3'UTR结合而调控其表达。将Dicer1基因干涉掉或者miRNAs拮抗剂处理均能增加BrZ2的表达,而miR-8或者miR-429的激动剂处理也能下调BrZ2在转录水平和蛋白水平的表达,这些结果均直接表明miR-8和miR-429靶作用于BrZ2。进一步研究结果表明miR-8和miR-429的激动剂均显著地促进了HaSNPV的复制和OB产物、缩短了染毒棉铃虫的LT50值和提高了染毒棉铃虫的死亡高度;而拮抗剂处理均显著地抑制了 HaSNPV复制和OB产物、延长了染毒棉铃虫的死亡时间和降低了染毒棉铃虫的死亡高度。总之,这些研究结果证明了 miR-8和miR-429通过下调BrZ2的表达参与20E和JH调控HaSNPV诱导的棉铃虫上爬行为。(5)由于HaSNPV感染显著地诱导棉铃虫HaTrx2和HaTrxR1基因的表达,所以进一步研究了它们的序列特征和基因功能。序列分析结果表明HaTrx2和HaTrxR1基因均是高度保守的,和其它昆虫同源物有较高的序列一致性。HaTrx2的mRNA在5龄96h的表达量最高,在幼虫的头和表皮表达量最高。HaTrxR1基因在5龄72 h和96 h的表达量最高,在马氏管、中肠和血细胞内的表达显著地高于其它检测的组织。HaTrx2和HaTrR1基因受到多种类型的逆境压力诱导。HaTrx2或者HaTrxR1基因的干涉增加了染毒棉铃虫血细胞内的ROS产物和脂质过氧化损伤,并且导致棉铃虫对病毒感染的敏感性增加,LT50值缩短。这些结果均表明HaTrx2和HaTrxR1基因参与棉铃虫抵抗HaSNPV的感染,并且为深入研究昆虫硫氧还蛋白系统提供理论基础。
[Abstract]:Many parasites promote their reproduction and propagation by manipulating host behavior. Lepidoptera larvae infect the baculovirus on the top of the host plant and eventually hang up death and liquefaction and release the virus particles. This behavior manipulation of the baculovirus is described as "tree-top disease" or "Wipfelkrankheit". The host climbing behavior induced by baculovirus has been shown to be regulated by the /EGT protein and light of the baculovirus EGF gene. However, it is not clear which genes in the host or miRNAs are involved in the regulation of host climbs induced by baculovirus. This study mainly used high throughput sequencing and RNAi to identify cotton bolls. A number of signaling pathways in the Helicoverpa armigera and their role in the climbing behavior induced by H.armigera singlenucleopolyhedrovirus (HaSNPV). The results mainly include the following 5 aspects. (1) first, 3 different test conditions were tested (greenhouse cotton, greenhouse cotton rope and reality). The results showed that the larvae of Helicoverpa armigera were dead at a higher position under the 3 experimental conditions, which indicated that the climbing behavior of HaSNPV induced cotton bollworm was the inherent characteristic of the host, which was not related to the experimental setting. At the same time, the death height of the infected larvae was increased with the increase of the virus concentration. (2) high throughput sequencing results showed that the larvae of Helicoverpa armigera were infected with 72 h after HaSNPV infection, and 5972 genes were expressed differently in the fat body. They mainly belonged to 20 signaling pathways, including ecdysone (20-hydroxyecdysone, 20E) and juvenile hormone (Juvenile hormone, JH) signaling pathway, immune and stress response signaling pathway, fatty acid generation. At the same time, HaSNPV infection significantly inhibited the 20E signal of Helicoverpa armigera and promoted the JH signaling pathway. Finally, the 20 differentially expressed genes were selected by qRT-PCR, and the expression trend of these differentially expressed genes was basically the same as that of the transcriptional sequence. (3) exogenous hormone treatment and RNAi The experiments show that the 20E signaling pathway regulates the climbing behavior of the cotton bollworm by affecting the HaSNPV replication, the OB product and the death height of the infected larvae. While the JH signal promotes the upstream crawling behavior of the cotton bollworm by antagonizing the 20E signal, the downstream key of the.20E and JH signaling pathway is successfully interfered with the BrZ2 and HaSNPV replication. Compared with the OB products and the control group, the LT50 of the infected larvae was significantly shortened and the death height increased significantly. (4) the miRNAs microchip sequencing results showed that 127 differentially expressed host miRNAs. in the fat body after cotton bollworm infection had predicted that miR-8 and miR-429 might be combined with 3'UTR of BrZ2 by 2 target prediction software. Dicer1 gene interference or miRNAs antagonist treatment can increase the expression of BrZ2, while miR-8 or miR-429 agonist treatment can also downregulate the expression of BrZ2 at transcriptional and protein levels. These results show that the results of miR-8 and miR-429 targets in BrZ2. further study indicate the excitement of miR-8 and miR-429. The agent significantly promoted the replication of HaSNPV and the OB products, shortened the LT50 value of the infected cotton bollworm and increased the death height of the infected cotton bollworm, while the antagonist treatment significantly inhibited the HaSNPV replication and the OB products, prolonged the death time of the infected cotton bollworm, and reduced the death height of the infected cotton bollworm. It was proved that miR-8 and miR-429 participated in 20E and JH regulation of HaSNPV induced climbing behavior of Helicoverpa armigera by 20E and JH. (5) the sequence characteristics and gene function of cotton bollworm were further studied by HaSNPV infection. The sequence analysis results showed that both HaTrx2 and HaTrxR1 genes were both. Highly conserved, mRNA in the 5 age 96h was highest in the 5 age 96h, and the highest expression of the.HaTrxR1 gene in the head and epidermis of the larvae was highest at 5 age 72 h and 96 h. The expression in the martensitic tube, midgut and blood cells was significantly higher than that of the other tissues,.HaTrx2 and HaTrR1. The interference of.HaTrx2 or HaTrxR1 gene induced by various types of stress increased the ROS products and lipid peroxidation damage in the blood cells of the infected cotton bollworm, and caused the increase in susceptibility to virus infection and the shortened LT50 value of the cotton bollworm, which showed that the HaTrx2 and HaTrxR1 genes were involved in the infection of the cotton bollworm against HaSNPV. It also provides a theoretical basis for further study of insect thioredoxin system.
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S476.13

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本文编号：1928381