桃褐腐病菌和炭疽病菌对DMI杀菌剂的抗性研究

发布时间：2018-06-02 08:33

本文选题：桃褐腐病 + 桃炭疽病　；参考：《华中农业大学》2017年博士论文

【摘要】：Monilinia spp.和Colletotrichum spp.是危害桃树健康生长的重要病原物,分别能引起桃褐腐病和桃炭疽病。本研究以这两类桃树主要病原菌为研究材料,探寻了其对包括DMI类杀菌剂在内的几种主要单作用位点杀菌剂的抗性现状和抗性机理。在我国桃褐腐病菌优势种Monilinia fructicola中,系统调查了其对4种主要杀菌剂的敏感基线及其对DMI类杀菌剂抗性产生的分子机理。并针对其抗性产生机理,设计了一款利用环介导等温扩增(LAMP)方法进行田间抗性菌株检测的试剂盒。在Colletotrichum spp.中,明确了造成美国东南部桃炭疽病的病原菌,并调查了桃炭疽病菌对DMI类杀菌剂的敏感性,同时对桃炭疽病菌中产生DMI抗性的分子机理进行了探寻。研究结果为综合防治桃褐腐病和桃炭疽病提供了科学依据和技术支持。所获得具体研究结果如下:(1)采集了80株来自我国5个主要产桃省份(市)的商用果园中的桃褐腐菌株,并测定了它们对MBC类杀菌剂多菌灵、QoI类嘧菌酯、DMI类戊唑醇和SDHI类啶酰菌胺的敏感性。其中,采自云南省的16株菌株中,15株对多菌灵产生了抗性。这些抗性菌株的抗性水平稳定,不表现出适合度下降的现象,并且和乙霉威产生负交互抗性。离体接种试验表明,推荐浓度多菌灵无法有效控制抗性菌株在桃上产生的危害。分子水平研究表明,抗性的产生是由β-微管蛋白基因(TUB2)的E198A突变所致。采自福建的10株菌株中,3株具有对嘧菌酯的低等抗性。和多菌灵抗性菌株不同,这些菌株的抗性不稳定,且伴随着适合度下降的现象,在靶标基因细胞色素b(Cyt b)上,未发现任何点突变。嘧菌酯敏感菌株的抑制中浓度(EC50)为0.02到1.94μg/mL,平均值为0.54μg/m L。所有测定菌株对戊唑醇均敏感,平均EC50为0.03μg/m L。啶酰菌胺对菌株的EC50在0.01到3.85μg/mL之间,平均值为1.02μg/mL。试验结果表明,对中国大部分地区的桃褐腐菌株而言,MBC类、QoI类、DMI类和SDHI类杀菌剂都能起到较好的防效,但MBC类杀菌剂的抗性菌株已经出现。(2)前期已明确65bp的Mona元件和桃褐腐病菌DMI抗性产生相关,本研究通过遗传转化试验,明确了Mona具有启动子活性,并通过一系列删减转化子,将Mona的活性区域进一步缩小为20bp。(3)基于Mona元件及其侧翼序列,开发了一款利用环介导等温扩增技术(LAMP),快速检测田间DMI抗性桃褐腐菌株的试剂盒。利用此方法,可以特异地检测出MfCYP51上游的Mona插入,在75min内,通过加入SYBR Green I染料,观测结果。试验中利用该方法,成功检测了51株桃褐腐菌株样本对DMI杀菌剂的敏感性。该方法特异性强,专化性高,不会误检出其它6种桃树上常见病原菌。同时,该方法灵敏度高,可以检测到10 fg的DNA模板,比普通PCR方法灵敏100倍。试验还开发了直接以菌丝为模板,检测其抗性是否产生的方法。由于LAMP方法具备结果可靠、操作简便、不需实验室昂贵仪器等特点,适于DMI抗性菌株的田间检测。(4)就桃炭疽病菌而言,试验从美国南卡罗来那州和佐治亚州的商用桃园中采集了Colletotrichum acutatum复合种菌株,整合分析其ITS、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)、β-微管蛋白(TUB2)基因序列,将这些复合种菌株细分成了Colletotrichum nymphaeae和Colletotrichum fioriniae 2个种。接着调查了这2个种,及另外3个采集自美国东南部的桃炭疽种(Colletotrichum fructicola,Colletotrichum siamense和Colletotrichum truncatum),对包括苯醚甲环唑、丙环唑、戊唑醇、叶菌唑、粉唑醇和腈苯唑在内6种DMI类杀菌剂的敏感性。结果表明,C.truncatum对戊唑醇、叶菌唑、粉唑醇和腈苯唑产生了抗性,C.nymphaeae对粉唑醇和腈苯唑产生了抗性。C.fructicola和C.siamense对所有的6种DMI类杀菌剂都敏感(EC50值分别为0.2到13.1μg/mL)。C.fioriniae中的一个分支(命名为C.fioriniae亚群2)整体上比另一个分支(命名为C.fioriniae亚群1)对以上杀菌剂较为不敏感,其EC50值分别为0.5到16.2μg/m L,及0.03到2.1μg/mL。对所有测定的5个种而言,苯醚甲环唑和丙环唑都具有最好的防效(EC50值为0.2-2.7μg/m L),戊唑醇和叶菌唑对除了C.truncatum以外的其它种有较好的防效。试验表明,苯醚甲环唑和丙环唑应作为防治桃炭疽病的首选DMI类杀菌剂。(5)首次克隆了DMI类杀菌剂天然抗性种C.truncatum的CYP51A和CYP51B基因,并发现该抗性的产生可能是由CYP51B上H373N、M376L和S511T,或者CYP51A上L208Y、H238R、S302A、I366L点突变所造成。
[Abstract]:In this paper , the resistance of strains of peach brown rot and peach was studied . ( 3 ) Based on the Mona element and its flanking sequences , a kit using loop - mediated isothermal amplification ( LAMP ) was developed . The results showed that C . truncatum could be used as the first kind of bactericide for the control of E . truncatum . The EC50 values were 0.2 - 2.7 渭g / mL , 0.03 - 2.1 渭g / mL .
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S436.621

【参考文献】