过表达LaMIR166a在落叶松ESMs成胚发育及其萌发过程中的功能研究

发布时间：2018-06-04 17:06

本文选题：落叶松 + 体细胞胚胎发生　；参考：《中国林业科学研究院》2017年博士论文

【摘要】：落叶松体细胞胚再生体系是对针叶树进行分子遗传改良、研究裸子植物早期发育调控和形态发生的理想模式系统。然而在实践中仍然存在体细胞胚畸形率高、萌发率低等问题。前期研究发现,过表达miR166a前体基因LaMIR166a后,落叶松体细胞胚顶端发育异常,这与生长素极性运输抑制剂N-1-萘基酞氨酸(N-1-naphthylphthalamic acid,NPA)处理的结果类似,表明miR166及其目标基因LaHDZ31-34与生长素信号途径共同参与调控落叶松体细胞胚形态建成。本研究以落叶松胚性细胞系S287为受体材料,通过过表达LaMIR166a研究了胚性胚柄团(Embryogenic Suspensor Mass,ESMs)成胚发育以及体细胞胚萌发过程中miR166a的功能,发现该过程中miR166a对生长素信号途径存在的调控作用。主要研究结果如下:(1)采用农杆菌介导的遗传转化方法,将LaMIR166a的过表达载体稳定转化落叶松ESMs,筛选出6个抗性细胞系,并获得qRT-PCR验证。与野生型相比,过表达LaMIR166a表现为落叶松ESMs增殖速率减慢、子叶胚畸形子叶数目增多、萌发率增加以及转化植株侧根数目增加等。(2)在鉴定出落叶松IAA信号途径相关基因LaNIT和LaARF基础上,对它们的的表达模式进行分析。发现LaNIT和两个LaARF基因在落叶松体细胞胚发育过程的早期发育阶段上调表达。IAA检测结果显示,在此过程中IAA含量上升。表明落叶松体细胞胚发育的早期阶段,LaNIT参与了IAA的生物合成,且IAA信号通路在这个过程中发挥重要作用。(3)qRT-PCR结果显示,LaNIT与LaHDZ31-34表达模式相吻合,均在胚胎发育早期表达急速上调,说明LaHDZ31-34对LaNIT可能存在正向调控。同时发现miR166a与LaHDZ31-34在体细胞胚发育过程中不呈现完全负调控的表达模式,暗示miR166a对LaHDZ31-34的调控作用具有发育阶段特异性。(4)提出了miR166a/HDZIPⅢ调控落叶松体细胞胚萌发的网络模型。揭示了HDZIPⅢ在转录后受到miR166a的调控,并正向调控LaNIT的表达,影响IAA的合成,进而引起LaARF1和LaARF2表达的改变,调控落叶松体细胞胚的萌发。(5)采用农杆菌介导的遗传转化方法,将LaMIR166a的过表达载体转化烟草,qRTPCR筛选后获得3个转基因株系。表型分析发现转基因植株主根长度、基部直径、侧根密度、茎基部直径以及茎节间长度均显著高于野生型;茎部切片、根部压片和显微观察显示,过表达LaMIR166a明显促进茎部木质部的形成和发育,根毛数量增多、根毛增长、形态弯折等。(6)针对LaMIR166a及其目标基因LaHDZ31分别构建了两个CRISPR/Cas9载体,通过农杆菌介导的遗传转化方法,共获得了33个抗性细胞系。经HPT PCR检测,确定这些CRISPR/Cas9表达载体均已成功转化落叶松胚性细胞系。对pZJP15载体抗性细胞系进行酶切验证,结果呈阳性;需要进一步测序验证。综上所述,miR166/HD-ZIPⅢ在落叶松体细胞胚发生中发挥了重要的调控作用,研究结果为进一步研究裸子植物体细胞胚发育的分子调控机理以及获得高效稳定的干细胞繁育体系提供科学依据。
[Abstract]:In this study , we found that the expression of miR166a and LaHDZ31 - 34 in the development of somatic embryos of Larix gmelinii was significantly higher than that of wild type . ( 5 ) By using Agrobacterium - mediated genetic transformation method , three transgenic lines were obtained by transforming the over - expression vector into tobacco and qRTPCR . The phenotype analysis showed that the length of the main root , the diameter of the base , the density of the lateral root , the diameter of the base and the length of the stem were significantly higher than that of the wild type .
【学位授予单位】：中国林业科学研究院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S791.22

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