利用酵母双杂交解析WSSV感染凡纳滨对虾途径的研究

发布时间：2018-06-09 21:56

本文选题：酵母双杂交 + 凡纳滨对虾　；参考：《中国科学院研究生院(海洋研究所)》2016年博士论文

【摘要】：作为最重要的海洋水产养殖种类之一,凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的养殖产量占据了世界甲壳动物养殖产量的半壁江山(2013年,49.4%)。但是自上世纪九十年代起,伴随着对虾养殖业的蓬勃发展,各类病害如白斑综合症病毒(WSSV)等威胁也与日俱增。现有研究表明,消化道和鳃是WSSV侵入对虾体内的重要关口,其上可能存在与WSSV相互作用的蛋白。为了了解WSSV的侵染机制,最终找到防治WSSV办法,在本研究中,我们利用酵母双杂交系统寻找与WSSV囊膜蛋白存在相互作用的凡纳滨对虾消化道和鳃组织蛋白,研究内容和结果如下:1、构建了凡纳滨对虾消化道酵母双杂交文库。提取凡纳滨对虾消化道总RNA用于构建消化道cDNA初级文库,以此初级文库为cDNA来源构建了凡纳滨对虾消化道酵母双杂交文库。将文库菌液稀释后涂布在SD/-Leu平板上,通过计数推算出文库总克隆数约为1.65×107。从SD/-Leu平板上随机挑取20个克隆进行平均插入片段长度鉴定,结果显示插入片段平均长度大于1.2 kb。文库总克隆数与插入片段平均长度结果显示构建的凡纳滨对虾消化道酵母双杂交文库符合后续筛选要求,达到了预期目标。2、构建了凡纳滨对虾鳃酵母双杂交文库。提取凡纳滨对虾鳃总RNA用于构建鳃双链cDNA文库,并对构建的双链cDNA文库进行了均一化处理。通过二轮均一化处理,成功的将高丰度基因含量降低约32倍。随后利用均一化后的文库为cDNA来源构建了凡纳滨对虾鳃酵母双杂交文库。将文库菌液稀释后涂布在SD/-Leu平板上,通过计数推算出文库总克隆数约为1.5×106。从SD/-Leu平板上随机挑取24个克隆进行平均插入片段长度鉴定,结果显示插入片段平均长度大于800 bp。文库总克隆数与插入片段平均大小结果显示构建的凡纳滨对虾鳃酵母双杂交文库符合后续筛选要求,达到了预期目标。3、尝试构建WSSV囊膜蛋白VP13B、VP19、VP24、VP26、VP28、VP31、VP32、VP37、VP38A、VP39B、VP41A、VP41B、VP51A、VP51B、VP60A和VP73的诱饵菌株,发现VP13B、VP26和VP31存在自激活作用,其余13个WSSV囊膜蛋白的诱饵菌株均可用于酵母双杂交筛选。随后以VP28、VP37和VP51A作为诱饵蛋白,分别与凡纳滨对虾消化道酵母双杂交文库和鳃酵母双杂交文库进行酵母双杂交筛选。通过筛选、序列比对和与课题组的凡纳滨对虾转录组数据比对分析,从凡纳滨对虾消化道酵母双杂交文库获得了60个阳性克隆,插入片段可以比对上24条不同的Unigene,从凡纳滨对虾鳃酵母双杂交文库获得了51个阳性克隆,插入片段可以比对上22条不同的Unigene。经过分析,在筛选结果中发现1条Unigene可注释为peritrophin[Litopenaeus vannamei],命名为LvPT。LvPT含有276个氨基酸,1-19位氨基酸为信号肽,在90-149、151-198和200-257位氨基酸各有1个的2型几丁质结合结构域。4、在酵母双杂交系统中重新验证了LvPT与VP37的相互作用,并发现LvPT还分别与VP32、VP38A、VP39B和VP41A在酵母双杂交系统中存在相互作用;通过免疫共沉淀实验进一步确认了LvPT与VP37在酵母双杂交系统中的结果。根据LvPT的结构域功能实验和半定量PCR结果推测,LvPT在凡纳滨对虾体内极有可能是一种具有外分泌特性的几丁质结合蛋白,并且参与了凡纳滨对虾围食膜的形成,是凡纳滨对虾围食膜重要的结构蛋白之一。5、合成LvPT的肽段(CKQEGRYPDLLNQQ)作为抗原免疫新西兰大白兔,获得了LvPT的多克隆抗体。抗体检测结果显示在凡纳滨对虾胃总蛋白中可以特异性地检测到LvPT,条带大小在27 kDa左右。随后使用双链RNA干扰技术在转录水平沉默LvPT表达后,采用反向灌肠作为攻毒方式进行WSSV攻毒实验。攻毒实验结果显示,在攻毒48h和72h后,实验组对虾(LvPT dsRNAi+WSSV)游泳足、胃和肠组织中的病毒拷贝数显著低于对照组(EGFP dsRNAi+WSSV),说明在LvPT表达受到抑制后,WSSV在消化道内侵染受到了明显的抑制,提示在WSSV侵染对虾消化道的过程中,LvPT可能作为吸附因子,辅助病毒粒子完成侵染。
[Abstract]:As one of the most important species of marine aquaculture , Litopenaeus japonicus ' s aquaculture production accounted for half of the world ' s largest aquaculture production ( 49.4 % in 2013 ) . A double - hybrid library was constructed . The results showed that the average length of the inserted fragment was greater than 1.2 kb . The results showed that the total number of the inserted fragments was greater than 1.2 kb . In this paper , we have obtained 51 positive clones from the yeast two - hybrid library of the shrimp branchial yeast . The results show that in the yeast two - hybrid system , the interaction of LvPT and VP37 in the yeast two - hybrid system has been confirmed .
【学位授予单位】：中国科学院研究生院(海洋研究所)
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S945.4

【参考文献】