MYB和bHLH转录因子对马铃薯块茎花色素苷生物合成的调控机理研究

发布时间：2018-06-14 12:40

  本文选题：马铃薯 + 花色素苷　； 参考：《甘肃农业大学》2016年博士论文

【摘要】：马铃薯是世界范围内最重要的粮食作物之一,具有非常丰富的种质资源,其薯肉和薯皮具有白、红、紫等一系列色泽。彩色马铃薯不仅外形美观,而且富含花色素苷,同时四倍体彩色马铃薯所含色素主要是酰基化花色素苷,具有更好的稳定性和抗氧化活性。作为植物中最主要的黄酮类物质,花色素苷除赋予马铃薯各种颜色外,还在昆虫的传粉,生长素运输,保护叶片免受紫外线伤害,抗逆境等方面有重要的作用。作为天然色素,花色素苷可应用于食品、化妆品等行业,同时它被证明具有抗氧化、抗病毒、延缓机体组织衰老、抑制炎症和过敏、预防心血管疾病、提高人体免疫力、抗癌等作用,其医药价值更是备受关注。研究表明花色素苷的合成代谢受到转录因子的调控,目前已鉴定了三类参与花色素苷代谢合成的转录因子,分别为MYB家族成员、b HLH蛋白和WD40因子,其中R2R3MYB为最主要的转录调控因子。本研究对白色(新大坪)和紫色(黑美人)马铃薯品种的转录组进行高通量测序,并通过生物信息学方法筛选分析两组转录数据库(白皮/紫皮和白肉/紫肉)的差异表达基因,特别是和花色素苷合成相关的差异表达转录因子,并对转录因子的功能及调控机理进行深入的研究。研究中获得的主要结果如下:1.为了鉴定在马铃薯块茎中参与花色素苷合成的结构基因和调控转录因子,本研究利用Illumina Hi Seq 2000双末端测序技术对白皮白肉和紫皮紫肉马铃薯品种进行高通量测序,将RNA-seq数据库进行比对分析,在白皮/紫皮转录组数据库中鉴定了10499个差异表达基因,其中4387个基因上调,6112个基因下调;在白肉/紫肉转录组数据库中鉴定了8157个差异表达基因,其中3685个基因上调,4472个基因下调。我们进一步分析了在不同品种间和花色素苷合成相关的差异表达基因,鉴定出了新的可能参与花色素苷合成的结构基因和转录因子,包括在紫皮/白皮转录组数据库中的48个结构基因,26个MYB转录因子和27个b HLH转录因子,在紫肉/白肉转录组数据库中的45个结构基因,21个MYB转录因子和17个b HLH转录因子;并利用荧光定量PCR技术验证11个筛选出的差异表达基因,结果表明荧光定量PCR数据和RNA-Seq数据具有良好的相关性。同时进一步鉴定了两组数VI据库中的SNP并在UFGT,AN1和b HLH1基因中做了验证,结果和RNA-Seq数据均一致。2.为了对筛选出的候选MYB转录因子功能进行深入的研究,本研究从四个彩色马铃薯品种中分离出R2R3 MYB-St AN1转录因子的三个等位基因(基因家族),通过序列分析发现三个等位基因的差别在于C端由10个氨基酸序列组成的重复结构(R)数目的不同,根据R的数目,将其分别命名为R0,R1和R3。这些St AN1的等位基因在彩色组织中高表达,在白色组织中也有少量表达,通过q PCR和RNA-Seq结果发现白色品种St AN1的大部分转录本被截断;同时发现了一些新的R2R3 MYB转录因子St MYBA1和St MYB113的等位基因(基因家族),它们在白色块茎中也有很高的表达量。对这些R2R3 MYB转录因子在烟草中进行瞬时表达实验进行功能鉴定,结果发现含有一个重复结构R的等位基因St AN1-R1调控花色素苷合成的能力最强,进一步将R结构基因转移到缺少该结构的MYB序列中,发现R重复结构可以有效提高MYB基因调控花色素苷合成的能力。St MYBA1和St MYB113的等位基因(基因家族)也能够调控烟草叶片花色素苷的合成。烟草稳定遗传转化研究发现,St AN1和St MYBA1的等位基因(基因家族)可以显著提高烟草内源b HLH的表达以及结构基因的表达,促进烟草各个组织花色素苷的积累,其中St AN1-R1的调控能力最强,和瞬时表达实验结果相一致,且光是MYB转录调控必不可少的外界因素。3.为了对筛选出的候选b HLH转录因子功能进行深入的研究,本研究从四个品种中分离了五个Stb HLH1等位基因(基因家族)和一个St JAF13基因,进一步研究与MYB转录因子的结合与协同调控能力。研究发现从白皮和红皮中分离出的两个Stb HLH1等位基因没有功能,其余三个Stb HLH1等位基因与MYB转录因子具有不同的协同调控能力,但必须要被St JAF13转录因子所激活,Stb HLH1s和St JAF13基因只在彩色组织中高表达。4.综合结果分析表明,St AN1是调控花色素苷合成的重要转录因子,其等位基因的调控能力与花色素苷的积累程度密切相关,当St AN1,St MYBA1和St MYB113在彩色块茎组织甚至白色组织中都表达,Stb HLH1和St JAF13转录因子才是最重要的协同调控因子。RNA-Seq和q PCR结果表明,在马铃薯白色块茎组织中,St AN1的大部分转录本被截断,因此可推测在白色组织中,由于St AN1转录本的不同加工过程以及Stb HLH1等位基因失去功能等原因造成Stb HLH1和St JAF13的表达无法被激活,进而导致无法合成花色素苷;彩色马铃薯块茎组织中花色素苷积累量的不同是因为内源MYB和b HLHs等位基因的结合和协同调控能力的不同,以及失去功能的转录因子等位基因的竞争抑制所致。
[Abstract]:In order to identify the structural genes involved in the synthesis of anthocyanin and to regulate the transcription factors , it has been proved to have antioxidant , antiviral , anti - aging , anti - adversity and so on . It has been proved that the synthesis and metabolism of anthocyanin is regulated by transcription factors . Three alleles ( gene families ) of the transcription factors of R2R3 MYB - St AN1 were isolated from four color potato varieties . The results showed that the alleles ( gene family ) of St AN1 and St MYB113 had the strongest ability to control the synthesis of anthocyanin . Stb HLH1 and St JAF13 transcription factors are the most important co - regulation factors in color tubers and even white tissues . The results of RNA - Seq and q - PCR indicate that in the white tissue of potato , the expression of Stb HLH1 and St JAF13 can not be activated due to the different processing processes of St AN1 transcript and the loss of function of Stb HLH1 allele .
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S532
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本文编号：2017416