PCV2体外培养特性的研究及HMGCR对PCV2复制的影响

发布时间：2016-12-03 07:40

  本文关键词：PCV2体外培养特性的研究及HMGCR对PCV2复制的影响，由笔耕文化传播整理发布。

《吉林大学》 2015年

PCV2体外培养特性的研究及HMGCR对PCV2复制的影响

杨鑫  

【摘要】：猪圆环病毒2型（PCV2）引起的猪圆环病毒病（PCVAD）呈世界性分布，，是近几年影响世界养猪业最重要的病毒性传染病之一，目前本病尚无特效药物。一方面由于该病毒生长较为缓慢，在体外培养时病毒滴度较低；另一方面PCV2基因组小，编码蛋白数量少，从而限制了靶向抗病毒药物的研发。因此，研究PCV2培养特性、PCV2与宿主的相互作用，对于深入了解病毒的致病机理、寻找阻断病毒复制的方法、筛选有效的药物靶标具有非常重要的理论意义和实际应用价值。 本研究从断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）患病猪的肺脏中分离了一株PCV2，将其命名为PCV2CC1毒株。通过全基因组测序确定其基因分型为PCV2b型。 PCV2基因组小，编码蛋白数量少，需要依赖宿主蛋白来完成其复制周期。根据PCV2的复制特点分别用D-氨基葡萄糖、NH4Cl、甲基-β-环糊精（MβCD）、艰难梭菌毒素B、刀豆蛋白A（ConA）、重组猪II型白介素（IL-2）和干扰素γ（IFN-γ）处理PK-15细胞系，并对PCV2的增殖效果进行比较。结果表明IL-2、ConA、D-氨基葡萄糖和MβCD可持续促进PCV2在PK-15细胞系中的增殖，且D-氨基葡萄糖、ConA和甲基-β-环糊精联合处理对PCV2增殖的促进效果更为明显。 3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（HMGCR）是胆固醇生物合成途径的限速酶，可参与多种病毒的感染过程，然而目前尚无HMGCR与PCV2感染相关的报道。前期实验表明，用MβCD处理宿主细胞降低细胞膜胆固醇后，可促进病毒的复制。因此，推测HMGCR对PCV2感染有影响。本研究发现，接种PCV2后PK-15细胞系中HMGCR的磷酸化水平升高，说明PCV2感染可降低细胞中HMGCR活性，因此推测HMGCR可能影响PCV2在PK-15细胞系中的复制。通过转基因方法构建了稳定的HMGCR高表达细胞株PK-HMG；利用RNA干扰技术构建了HMGCR基因沉默细胞株PK-shHMG；根据显性负性突变原理，将猪源HMGCR的S869磷酸化位点突变，构建了HMGCR显性负突变细胞株PK-S869Amutant，从而检测上述细胞株中HMGCR的表达量对PCV2复制的影响。结果表明HMGCR高表达后PCV2的复制量显著下降，而HMGCR基因沉默细胞株中的PCV2复制效果则显著增强，说明PCV2的产量与宿主细胞中HMGCR的表达量呈负相关。 同时，还发现HMGCR显性负突变细胞株在接种PCV2后48h时即发生明显的细胞凋亡。比较几种细胞株在接种PCV2后48h时的细胞凋亡程度和Caspase-3的活性，结果表明与对照细胞和HMGCR基因沉默细胞相比，HMGCR显性负突变细胞在PCV2感染48h时发生更为明显的细胞凋亡，且Caspase-3活性显著升高；用Caspase-3抑制剂Z-VAD-FMK处理HMGCR显性负突变细胞后，细胞中Caspase-3的活性显著下降，而PCV2在HMGCR显性负突变细胞中的复制则显著增强，且与Caspase-3抑制剂的浓度呈剂量依赖关系。这些结果表明，HMGCR的表达量与PCV2诱导的细胞凋亡呈负相关。 为进一步证实上述结果，本研究构建了PCV2感染的BALB/c小鼠动物模型，采用灌胃的方法每日定量给药，从而在体内研究了HMGCR抑制剂(阿托伐他汀)对PCV2复制的影响。结果表明，阿托伐他汀处理可促进PCV2在小鼠体内的复制，与体外研究结果相符。对肠系膜淋巴结进行免疫组化检测，结果显示，PCV2主要定位于淋巴细胞的细胞质和细胞膜。

【关键词】：
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【目录】：

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本文编号：202786