伊氏线虫真菌比较基因组及其内生细菌的研究

发布时间：2018-06-22 05:43

本文选题：食线虫真菌 + Esteya　；参考：《中国林业科学研究院》2017年博士论文

【摘要】：由松材线虫(Pine Wood Nematode,PWN)引起的松树枯萎病在亚洲造成毁灭性的生态危害和经济损失。食线虫真菌能够捕杀线虫,是自然生态系统中重要的生态组成部分。伊氏杀线真菌(Esteya vermicola,Ev)是1995年发现的内寄生PWN的食线虫真菌,Ev能够在短时间内侵染并杀死PWN,其对PWN的高感染性和致死性使得Ev成为高潜力的生防菌株,但其进化历史和寄生适应机制尚不清楚,对食线虫真菌生活方式的分子基础知之甚少,不同食线虫真菌间的相似性和差异也是未知的。本研究中首次发现生防菌株Ev胞内存在内生细菌。共生在生物、生态和进化多样化过程中发挥了关键作用,共生细菌通过多种方式影响宿主的生物学。对Ev的基因组和比较基因组及内生细菌的研究有助于揭示其致病机制,为PWN的生物防治奠定重要的理论基础。Ev三代基因组测序和注释的主要结果如下:测序深度为104.66′,组装为50个contigs,并进一步装配为42个scaffolds,平均覆盖度为68.59′。该基因组的大小为34.2Mb,GC含量为49.26%,蛋白编码基因为8424个。8144个基因被注释,占总基因的96.68%。共鉴定到329个t RNA,27个5.8S rRNA、6个28S rRNA、7个18S rRNA。重复结构分析表明该基因组共有12,778个简单序列重复(Simple Sequence Repeat,SSR)。线粒体基因组大小为47,282bp,GC含量为24.85%。被注释的基因包括14个保守的蛋白编码基因,1个大rRNA亚基和1个小r RNA亚基,27个t RNAs。比较基因组分析表明三组病原真菌与它们入侵宿主的能力即生态适应性一致:食线虫真菌编码最高数量的粘附蛋白、参与入侵和致死活性的subtilases酶、锚定重复蛋白、亮氨酸重复蛋白、酪氨酸酶等相关蛋白;昆虫病原真菌编码更多的几丁质酶、肽酶、蛋白激酶和毒素等;植物病原真菌则编码较多的碳水化合物酶和过氧化物酶,特别是半纤维素酶、果胶裂解酶、角质酶和P450。特别地,内寄生真菌Ev突出地编码最高数量的铁转运蛋白、维生素转运蛋白和尿囊素转运蛋白,其潜在的转运尿素和铵的能力也很强,表明与其它食线虫真菌微观致病机制的不同。21株致病真菌中抗生素抗性基因的广泛存在表明了致病真菌在生态竞争中的适应性,有利于其在宿主中的定植。次级代谢分析表明2株内寄生真菌Ev和Hirsutella minnesotensis拥有更丰富的次级代谢产物合成基因,其合成的次级代谢产物将有助于在宿主线虫内定植。进一步的分泌蛋白预测表明,食线虫真菌含有丰富的与致病相关的胞外分泌蛋白,如subtilisin-like蛋白酶、lectin凝集素、几丁质酶、天冬氨酸蛋白酶和酪氨酸蛋白酶。Ev基因组编码天冬氨酸蛋白酶、葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、漆酶、纤维二糖脱氢酶、P450和尿素转运蛋白等胞外分泌蛋白的能力更强。基于基因组水平的系统发育和进化分析表明,Ev与其姊妹枝的植物病原真菌Grosmannia clavigera大约分化于1.3亿年前。基因家族收缩扩张分析结果证明了Ev许多转运蛋白家族经历了扩张,占总扩张基因家族的13.2%,远高于其他致病真菌。Ev与H.minnesotensis的种专一的基因家族比例(分别为17.6%和21.0%)和种专一的扩张基因家族比例(分别为84.0%和89.7%)在食线虫真菌组中是最高的,表明内寄生真菌未知的功能多样性值得更深入的研究。食线虫真菌中,一些重要的致病相关基因经历了扩张,如Subtilisin-like,蛋白酶S41、天冬氨酸肽酶和几丁质酶等。重要的致病相关的直系同源基因如氮调控基因、枯草杆菌蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和P450在食线虫真菌中经历了正向选择。食线虫真菌在攻击线虫方面具有进化趋同性,但其遗传结构和扩张基因家族不同。16S rRNA PCR扩增和细菌内毒素检测均发现来自不同地理区域的4株Ev胞内均存在内生细菌,荧光原位杂交(Fluorescence In Situ Hybridization,FISH)进一步证实了存在内生细菌的事实。基于16S rRNA系统发育分析表明4株Ev真菌的内生细菌全部聚簇在单系进化枝中,且该内生细菌隶属于γ-变形菌门(Gammaproteobacteria),与施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)亲缘关系最近。内生细菌的培养和消除试验表明该细菌不可人工培养,亦不可通过抗生素去除而获得单一的、非共生态的Ev真菌,该结果表明二者紧密的共生关系。FISH、透射电镜和扫描电镜等超微结构观察展示了该内生细菌是球状的。内生细菌的细胞直径大小约在50nm-2μm之间,并且不同大小的该细菌的细胞壁厚度差异很大。超微结构和核酸的荧光染色表明生长前期和后期的细菌在细胞大小、细胞壁厚度和繁殖程度不同。对内生细菌基本生物学的研究将有助于揭示内生细菌在生防真菌宿主进化和生态学作用的研究。
[Abstract]:The research of Ev ' s genome and comparative genome and endogenic bacteria has played a key role in the process of biological , ecological and evolutionary diversity . The results of this study are as follows : The genome of Ev is 34.2Mb , the average coverage is 49.26 % , the protein coding gene is 8424 . 8144 genes are annotated , accounting for 96.68 % of the total gene . The gene family showed that Ev and Hirsutella minnesotensis had more abundant secondary metabolites . The results showed that Ev and Hirsutella minnesotensis had more abundant secondary metabolites . Fluorescence in situ hybridization ( FISH ) further proved the existence of endogenous bacteria . Based on 16S rRNA system development , it was found that all the endogenous bacteria of Ev fungi were clustered in single - line evolution branches .
【学位授予单位】：中国林业科学研究院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S763

【相似文献】