黄芪种子萌发及后萌发时期的代谢变化分析

发布时间：2018-06-22 23:10

  本文选题：蒙古黄芪 + 种子荫发　； 参考：《东北林业大学》2016年博士论文

【摘要】：蒙古黄芪是(Astragalus membranaceus Bge. var. mongholicus Hsiao)豆科黄芪属的多年生草本植物。黄芪作为一种广泛使用的中草药,来源于蒙古黄芪或膜荚黄芪(Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.)的干燥根。目前,对蒙古黄芪的研究多集中于药理学、育种学等方面,对蒙古黄芪种子萌发阶段代谢情况的研究尚未见报道。种子的萌发是从休眠胚时期到发育为一个能够进行光合自养的个体的一系列转变过程,从浸种到成苗涉及诸多迅速而复杂的生理生化过程。因为在此阶段最易受到各种伤害,萌发被认为是植物一生中最重要的时期。因此,种子萌发过程的生理生化及代谢情况对黄芪植物生长、黄芪药材品质具有重要的意义。采用代谢组学技术揭示分析黄芪种子萌发过程中代谢物的变化规律及积累模式可以为解析种子萌发过程、调控代谢方向等研究提供理论依据。代谢组学以高通量检测和数据处理为手段,以信息建模与系统整合为目标,是理想的研究生物某阶段机体发生的各种代谢变化的技术手段。为了深入研究：(a)黄芪种子在初始萌发及后萌发阶段,以毛蕊异黄酮苷为代表的黄芪标志活性代谢物的动态变化及发育特异性积累情况；(b)在种子整个萌发阶段,初始萌发及后萌发时期的代谢谱差异及黄酮和皂苷类的代谢物变化。本论文以黄芪药材药典规定的源植物蒙古黄芪的成熟干种子为材料,以UPLC-MS和UPLC/Q-TOF为技术于段,以代谢组学为平台,从以下几个方面进行了探索研究：(1)研究黄芪种子从吸胀到子叶完全打开的整个发育期,根据形态学特征,按照种子萌发定义划分两种黄芪的萌发时期：蒙古黄芪种子从第0天至第3天,为种子初始萌发时期；从第3天至第7天,为种子后萌发时期。膜荚黄芪种子从第0天至第4天,为种子初始萌发时期；从第4天至第7天,为种子后萌发时期。(2)建立同时定量检测毛蕊异黄酮苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素及野黄芩苷的UPLC-MS方法。色谱条件为：8%乙腈(0-1min),8%-34%乙腈(1-1.5 min),34%乙腈(1.5-4min),34%-60%乙腈(4-6 min),60%乙腈(6-7 min),60%-8%乙腈(7-7.5 min),8%乙脯(7.5-9 min)。质谱条件为：毛蕊异黄酮苷m/z 446.9→284.2；毛蕊异黄酮m/z285.0→269.9；芒柄花素m/z 269.0→196.2;野黄芩苷(IS)m/z 463.0→287.0。毛蕊异黄酮苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素及野黄芩苷的色谱保留时间分别为2.23min,2.80min, 4.75min,2.06min。定量检测结果显示,在蒙古黄芪种子的整个萌发过程中,主要的目标代谢物都在种了初始萌发时期及后萌发时期表现出了明显的含量变化。结合种了萌发程中的形态学研究结果,以膜荚黄芪及目标化合物合成途径相关酶表达水平为佐证,这些目标化合物含量变化的时间点都与生长发育的形态建成的时间点吻合,而并非因吸胀时间变化而变化。推测黄芪种子中黄酮类次生代谢产物的变化受种子的生长发育时期调控。(3)利用UPLC/Q-TOF分析了黄芪种子初始萌发时期的表达图谱,结合多元变量统计分析方法,在ESI正离子模式下鉴定出了10个生物标志物,包括4个黄酮类化合物；3个脂肪酸；1个氨基酸；1个糖苷；1个黄芪皂苷以及一个其他代谢物。通过聚类分析发现潜在差异物在种子初始萌发时期的分布有着明显的差异,其中毛蕊异黄酮(Calycosin)在初始萌发完成时的积累达到种子初始萌发开始时的2倍,而最为突出的另一个黄酮类化合物芒柄花苷(Ononin)的积累量达到158倍。这些现象表明,黄芪种子在吸胀到萌发阶段多种代谢物共同调节,氨基酸、脂肪酸与糖苷类物质主要为种子吸胀时期提供能量,而皂苷类的化合物在种子萌发阶段含量降低,造成这一原因或许是因为其合成途径中某些关键代谢物的合成受到阻碍或是存在一些抑制物导致其合成量的降低。通过靶向代谢组学技术我们鉴定出8个黄酮类化合物合成前体,通过各化合物在种子初始萌发过程中含量差异的变化,推断导致黄酮类化合物合成的主要前体化合物为p-Coumaroyl-CoA和Liquiritigenin,因此可以通过提高这两种前体化合物的合成量来达到提高黄酮化合物的积累,从而来保障种子的萌发及环境的适应；鉴定出13个皂苷类化合物合成前体,其中代谢物Squalene (C00751), Cycloartenol (C01902), Farnesyl diphosphate (C00448)和Mevalonic acid (C00418)四种前体化合物在种子初始萌发期显著积累,可能正是因为这些代谢物的积累抑制了其他的代谢物的合成,从而影响了黄芪皂苷(Astramembranoside A)的合成。(4)利用UPLC/Q-TOF分析了黄芪种子后萌发时期的表达图谱,结合多元变量统计分析方法,在ESI正离子模式下鉴定出了15个生物标志物：其中包含5个氨基酸；2个黄酮类化合物；2个激素；1个糖类化合物；1个脂肪酸以及4个其他类型代谢物。通过聚类分析发现潜在差异物在种子后萌发时期的分布有显著差异,在种子后萌发时期过程中,糖类代谢物,氨基酸,黄酮类化合物,激素和脂肪酸都发生了巨大变化。这些现象表明,黄芪种子的后萌发阶段由多种代谢物共同调节,氨基酸,脂肪酸,黄酮类化合物与糖苷类物质主要积累在种子后萌发完成时期,为幼苗的形态建成以及植物的生长提供良好的能量基础。此外,黄酮类化合物在种子的初始萌发及后萌发阶段都被鉴定为显著的生物标志物,这可能说明黄酮类的化合物随着植物的生长发育其含量逐渐变化,表明其对植物的发育和生长起到了关键性作用。针对种子后萌发时期构建黄酮类化合物代谢调控网络。通过各化合物在种子后萌发时期中含量变化的差异,推断黄酮类化合物合成的主要前体化合物为Coumaroyl-CoA和Isoliquiritigenin。此外,种子初始萌发时期与种子后萌发时期黄酮类化合物代谢途径中各化合物发生了不同的变化,其中Isoliquiritigenin的含量在种子后萌发阶段持续增加,通过代谢网络构建后我们可知化合物Coumaroyl-CoA的变化规律与Ⅰsoliquiritigenin含量的变化成正相关作用。针对种子后萌发时期构建皂苷类化合物代谢调控网络。其中化合物(R)-5-Diphosphomevalonate (C01143)和Isopentenyl diphosphate (C00129)在种子后萌发时期显著积累。与种子初始萌发时期的网络构建图相结合,我们可以得到这样一结论,在黄芪种子整个萌发萌发程中,相同的代谢物在不同时期所呈现的变化规律不同,导致这种不一致的变化可能是由于其萌发过程中各相关基因表达量有所变化而导致的。
[Abstract]:Astragalus membranaceus is a perennial herb of the genus Astragalus of Leguminosae , which is a widely used Chinese herbal medicine derived from Astragalus membranaceus ( Astragalus membranaceus ) or Astragalus membranaceus ( Astragalus membranaceus ) . ( b ) The research on the metabolism of Astragalus membranaceus ( Astragalus membranaceus ) seeds during the germination of Astragalus membranaceus ( Astragalus membranaceus ) has not been reported . The research on the metabolism of Astragalus membranaceus ( Astragalus membranaceus ) seeds during the germination stage of Astragalus membranaceus ( Astragalus membranaceus ) has not been reported . The research on the physiological and biochemical characteristics and metabolic status of the seeds in the process of seed germination is the most important period in the process of seed germination .
( b ) During the whole germination stage of the seeds , the metabolic profiles of the initial germination and the post - germination period and the metabolite changes of the flavone and saponin were studied in this paper . The main part of the study was UPLC - MS and UPLC / Q - TOF .
from days 3 to 7 , the seed germination period is the seed germination period , and the seed of the membranous pods is from the first day to the fourth day , which is the initial germination period of the seed ;
The UPLC - MS method was established for the simultaneous quantitative detection of isoflavones , erigerin , manatein and scutellarin from days 4 to 7 . The chromatographic conditions were as follows : 8 % acetonitrile ( 0 - 1 min ) , 8 % -34 % acetonitrile ( 1 - 1.5 min ) , 34 % acetonitrile ( 1.5 -4 min ) , 34 % -60 % acetonitrile ( 4 - 6 min ) , 60 % acetonitrile ( 6 - 7 min ) , 60 % -8 % acetonitrile ( 7 - 7.5 min ) , 8 % preserved ( 7.5 -9 min ) . The mass spectrum conditions were as follows : M / z 446.9 鈫，

本文编号：2054617