乙烯诱导番茄花柄脱落的相关蛋白筛选及关键蛋白S1CDPK5验证

发布时间：2016-12-05 16:55

本文关键词：乙烯诱导番茄花柄脱落的相关蛋白筛选及关键蛋白S1CDPK5验证，由笔耕文化传播整理发布。

《沈阳农业大学》 2015年

乙烯诱导番茄花柄脱落的相关蛋白筛选及关键蛋白S1CDPK5验证

张晓林

【摘要】：器官脱落是自然界普遍发生的自然现象,但对农作物产量与质量产生重要影响。也已证明,乙烯具有促进番茄花器官脱落的作用,但目前为止关于乙烯诱导番茄花柄脱落过程中离区蛋白质组分析的研究还比较少,而番茄花柄脱落过程中磷酸化蛋白质组研究更是未见报到。因此本试验通过iTRAQ技术大规模分析乙烯和1-MCP诱导的番茄花柄脱落过程中离区蛋白和磷酸化蛋白。通过蛋白功能分析、生物信息学分析、RT-PCR和Western Blot验证蛋白的转录和磷酸化修饰作用,试图从蛋白质组学方面研究乙烯诱导番茄花柄脱落的分子机制。主要研究结果如下：1.运用iTRAQ技术分析了乙烯诱导番茄花柄脱落过程中离区的蛋白相对表达量,成功鉴定出1429个蛋白,其中差异显著的蛋白有166个(含383个肽段)。通过cluster软件对蛋白表达量聚类分析,将这些差异蛋白共分成8类,这些差异显著的蛋白中大部分是在乙烯诱导过程中上调表达的蛋白。2.首次采用iTRAQ技术对乙烯诱导番茄花柄脱落过程中离区的磷酸化肽进行定量分析,共鉴定出243个磷酸化肽(包含450个肽段)。通过-1.5≥磷酸化作用相对强度≥1.5、-0.6≥磷酸化作用相对强度取log2对数≥0.6、Mascot Score≥20、pRS Score≥50等4个标准筛选差异显著的磷酸化肽,最终筛选出85个差异显著的磷酸肽,包含138个磷酸化位点。3.利用GO注释分析,将蛋白定量试验和磷酸化蛋白定量试验中的差异蛋白,进行生物学途径,分子功能、细胞组分的Leve_2水平分类,166个差异蛋白共注释到了1833条GO注释信息,其中属于生物学途径的有994条,属于分子功能的有284条,属于细胞组件的有555条。73个差异磷酸化蛋白共注释到955条GO注释信息,其中属于生物学途径的有557条、属于分子功能的有135条、属于细胞组件的有263条。差异蛋白和磷酸化蛋白分别匹配到了79和24个KEGG代谢途径。蛋白定量试验和磷酸化蛋白定量试验中参与淀粉和蔗糖代谢途径的蛋白较多,分别为14和4个蛋白。表明乙烯诱导的番茄花柄脱落过程可能与淀粉和蔗糖代谢密切相关。4.对蛋白定量试验和磷酸化蛋白定量试验中鉴定到的差异显著的蛋白进行转录水平分析,在蛋白质组中,大部分基因的转录和翻译水平不一致。而在磷酸化蛋白定量试验中,大部分基因的转录和翻译后修饰水平一致。其中S-adenosylmethionine synthase, CELLULASE 4, Expansin, osmotin-like protein,Auxin-regulated protein基因可能是受乙烯调控。结合其他研究发现转录和翻译之间没有相关性,转录和磷酸化修饰的变化的一致性要大于转录和翻译的一致性。在蛋白定量试验和磷酸化蛋白定量试验中有25个相同的蛋白在这两个试验中得到了鉴定。对其中20个可能与脱落相关的蛋白进行转录水平分析发现本试验中磷酸化修饰作用的变化不是由于转录或翻译水平的变化而引起的。说明磷酸化蛋白定量试验数据有效可靠。5.建立了适合伯乐半干转印系统Trans-Blot(?)TurboTM的转膜体系,针对不同分子量蛋白采用适合的转膜缓冲液。通过将文渊阁生产的一抗稀释成不同倍数,免疫后发现,一抗最适稀释倍数为1：1000。利用western blot验证了SRL35329、CDPK5S523、CDPK5S527磷酸化作用强度与iTRAQ检测结果一致。6.采用iTRAQ技术鉴定出的138个差异显著磷酸化位点中,丝氨酸,苏氨酸、酪氨酸分别占：68%、29%、3%。Motif-X分析发现,这些磷酸化位点的修饰方式有：[sP]、[Axxxxxs]、[txxxxxxxxxT]、[txxT]、[Txt]、[Kxxxxxt]6种。7.获得SICDPK5基因的全长,并成功连入T载体。利用Takara公司的MutanBESTKit试剂盒成功将CDPK5第527位的S(AGC)突变为A (GCC)。利用Gateway技术成功将SlCDPK5和SICDPK5S527A基因全长连入表达载体pB7YWG2,并转化到农杆菌中。8. TMpred预测SlCDPK5在255～273位存在一个跨膜结构域,TargetP 1.1 Server对CDPK5进行亚细胞定位预测显示,SlCDPK5主要分布在除叶绿体和线粒体之外的细胞其他位置。烟草瞬时表达证明SlCDPK5的确是在细胞膜附近表达量较高,而SlCDPK5S527A只在细胞中均匀表达。说明SlCDPK5的磷酸化作用能够影响其蛋白的亚细胞定位。

【关键词】：
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S641.2
【目录】：

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