狂犬病病毒样颗粒的构建、制备及免疫效果评价

发布时间：2016-12-06 10:09

  本文关键词：狂犬病病毒样颗粒的构建、制备及免疫效果评价，由笔耕文化传播整理发布。

《吉林大学》 2015年

狂犬病病毒样颗粒的构建、制备及免疫效果评价

齐瑛琳  

【摘要】：狂犬病是重要的人兽共患传染病，包括人在内几乎所有哺乳动物均易感。狂犬病在超过150个国家和地区发生，每年致超过5500人死亡，95%人类死亡病例发生在非洲和亚洲，这些地区犬类狂犬病潜在威胁超过30亿人。狂犬病由狂犬病病毒（rabies virus, RABV）感染所致，RABV具嗜神经性，感染中枢神经系统，病死率近乎100%。狂犬病是疫苗可防控的疾病，预防人类狂犬病最为经济有效的策略就是通过疫苗免疫消除犬狂犬病，大部分发达国家，通过犬只大规模疫苗接种消除了犬狂犬病，进而显著降低人类狂犬病发病数。因此，安全、有效、经济适用的狂犬病疫苗是十分重要的。 病毒样颗粒（virus-like particle, VLP）是由病毒的一种或几种结构蛋白在体外以自主装配方式形成的一种粒子，形态和结构上模拟天然病毒，不含遗传物质，无感染和复制能力。VLP以正确构象和高度重复的形式展示抗原表位，具有良好免疫原性，同时诱导体液和细胞免疫，为宿主提供抵御病原微生物感染的能力。VLP已成为众多病原微生物新型疫苗的研究热点，流感VLP疫苗、乙型肝炎VLP疫苗等已进入临床试验或批准上市。但目前为止，有关狂犬病病毒样颗粒（rabies VLP）构建研究的报道却是极少的。因此，本论文利用杆状病毒昆虫细胞表达系统构建生产rabies VLP，并对其免疫原性进行研究。 第一章：狂犬病病毒样颗粒的构建与制备。RABV糖蛋白（glycoprotein, GP）是唯一刺激并诱导机体产生病毒中和抗体（virus neutralizing antibody, VNA）的结构蛋白，基质蛋白（matrix protein, MP）决定了RABV合成、出芽，维持病毒形态，且MP上具有GP专一性结合位点，影响GP在病毒包膜表面的构象。因此，本研究选择RABVEvelyn-Rokitnicki-Abelseth（ERA）株GP和MP作为构建rabies VLP基本组装元件。构建并拯救分别表达GP和MP的重组杆状病毒（recombinant baculovirus, rBV），共感染悬浮培养Sf9细胞，收获上清并经蔗糖密度梯度离心纯化rabies VLP。电镜观察可见大小在180~200nm、纤突明显的圆形或椭圆形rabies VLP，Western Blot分析显示rabies VLP由GP和MP组成，免疫电镜检测证实rabies VLP表面纤突为GP。成功构建并生产出由RABVERA株GP和MP装配形成的rabies VLP，命名为EVLP。 第二章：嵌合型狂犬病病毒样颗粒的构建与制备。鞭毛蛋白（flagellin）作为Toll样受体（toll-like receptor, TLR5）5天然激动剂，有效诱导天然免疫，触发B细胞和T细胞参与的适应性免疫。大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基（LTB）与神经节苷脂GM1高度亲和，增强抗原提呈能力，诱导淋巴细胞增殖与分化，提高机体免疫应答。因此，本研究选择flagellin和LTB作为rabies VLP膜锚定形式的分子佐剂。分别构建含GP跨膜区和胞质尾区的flagellin和LTB融合基因，拯救分别表达flagellin和LTB融合基因的两株rBV，并以分别表达GP、MP和flagellin或LTB的三种rBV共感染悬浮培养Sf9细胞，收获上清并蔗糖密度梯度离心纯化两种嵌合型rabies VLP。电镜观察可见大小在180~200nm、纤突明显的圆形或椭圆形嵌合型rabies VLP，，Western Blot分析显示两种嵌合型rabies VLP由GP、MP和flagellin或LTB组成，免疫电镜检测证实flagellin和LTB分别成功插入两种嵌合型rabies VLP。成功构建并生产出由RABV ERA株GP、MP和flagellin或LTB装配形成的两种嵌合型rabies VLP，分别命名为EVLP-F和EVLP-L。 第三章：狂犬病病毒样颗粒免疫效果评价。通过肌肉注射免疫小鼠和犬，评价EVLP、EVLP-F和EVLP-L免疫效果以及是否具有开发成新型狂犬病疫苗的潜能。小鼠免疫显示，三种rabies VLPs均具有免疫原性，但与EVLP相比，EVLP-F和EVLP-L诱导更快更强的VNA反应，触发显著增多的分泌IFN-γ或IL-4的CD4+T和CD8+T细胞；两种嵌合型rabies VLP免疫后在腹股沟淋巴结募集和/或活化更多的B细胞和树突状细胞（dendritic cell, DC）；EVLP-F诱导产生强大的特异性IgG2a抗体反应，活化倾向于Th1型免疫应答；与之相反，EVLP-L触发更倾向于IgG1血清抗体反应；EVLP免疫仅保护部分小鼠免受RABV致死性攻击，而EVLP-F和EVLP-L所诱导显著增强的体液和细胞免疫应答为小鼠提供完全保护用于抵抗RABV感染。更为重要的是，与EVLP相比，EVLP-F和EVLP-L同样在犬体内诱生更高的VNA滴度及显著增强的外周血淋巴细胞IFN-γ和IL-4分泌反应，并保护所有免疫犬在RABV致死性攻击中存活。三种rabies VLP均具有免疫原性，但膜锚定形式flagellin和LTB在嵌合型rabiesVLP中发挥强大的佐剂活性，与EVLP相比，EVLP-F和EVLP-L在小鼠和犬体内均诱导产生显著增强的RABV特异性体液和细胞免疫反应，并保护免疫动物远离RABV感染。因此，rabies VLP具有开发成为安全有效的新型动物用狂犬病疫苗的潜能。 第四章：板蓝根多糖对狂犬病病毒样颗粒免疫原性的影响。佐剂是疫苗的重要组成部分，能提高抗原免疫原性，诱导增强型免疫应答反应。中草药中一种主要的生物活性成分为多糖，具有广泛药理学活性，特别是在免疫调节和抗肿瘤作用上。IIP-A-1是一种从传统中草药板蓝根中提取纯化的α-葡聚糖。本研究将EVLP联合IIP-A-1作为抗原，肌肉注射免疫小鼠，详细分析其诱导的免疫反应，并进一步评估IIP-A-1佐剂活性及是否具有开发成为新型佐剂用于VLP或其他抗原的潜力。与单一EVLP免疫相比，EVLP联合IIP-A-1共免疫显著增强先天性和适应性免疫应答反应，包括B细胞和DC募集和/或活化，T淋巴细胞增殖和活化，分泌IFN-γ或IL-4的CD4+T和CD8+T细胞分化，RABV特异性VNA产生；此外，低剂量EVLP混合IIP-A-1后能触发与单一高剂量EVLP诱导产生的相似强度的免疫应答反应；更为重要的是，EVLP联合IIP-A-1诱导的显著增强的免疫反应能完全保护免疫小鼠抵抗RABV致死性攻击。结果暗示板蓝根提取物α-葡聚糖IIP-A-1具有明显的免疫增强活性，具有开发成为新型佐剂的特性，用于VLP疫苗或其他类型疫苗。

【关键词】：
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【目录】：

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本文编号：206192