针对禽白血病病毒整合酶的抗病毒机制及泛素化修饰研究

发布时间：2016-12-15 21:47

  本文关键词：针对禽白血病病毒整合酶的抗病毒机制及泛素化修饰研究，由笔耕文化传播整理发布。

《中国农业大学》 2015年

针对禽白血病病毒整合酶的抗病毒机制及泛素化修饰研究

王占新  

【摘要】：禽白血病病毒ivian leukosis virus, ALV)属于反转录病毒属成员,能引起鸡发生肿瘤性疾病,近些年来,ALV-J亚型在我国鸡群中广泛传播,给养鸡业造成了巨大经济损失。然而到目前为止,对ALV的感染还没有有效的商品化疫苗和治疗措施。反转录病毒复制过程中重要的限速步骤是将病毒逆转录的cDNA整合到宿主基因组中,而催化这一过程的关键性酶便是整合酶(integrase,IN)。已有研究表明,整合酶除具有整合功能外,还能参与病毒的脱衣壳、反转录、病毒蛋白的表达、病毒粒子的包装等过程,而要完成如此众多的生物学功能,必需要有宿主蛋白的参与。然而关于ALV整合酶与宿主蛋白相互作用的研究报道非常少。基于此,本论文筛选了与ALV整合酶相互作用的宿主蛋白并研究了其分了机制,为全面揭示ALV和宿主细胞的相互作用及防控该疾病策略的制定奠定基础。 本实验首先通过酵母双杂交技术,以ALV的整合酶为“诱饵蛋白”从鸡法氏囊文库中筛选到了与其相互作用的宿主蛋白CSN6(COP9signalosome subunit6);随后,利用免疫共沉淀技术在人293T细胞中证明过表达的CSN6和IN可以发生蛋白间相互作用。通过内源性免疫共沉淀证明了在鸡DF-1细胞中过表达的IN能够结合细胞内源的CSN6,同时也证明了在ALV-J感染时CSN6可以结合内源性的IN；通过GST-pull Down实验证实了CSN6能够与ALV IN直接结合,并通过其C端介导与ALV-J IN的结合,结合位置是IN的催化中心；激光共聚焦技术证明了CSN6和ALVIN共表达时存在共定位。 在病毒复制实验中,发现当DF-1细胞过表达CSN6后,细胞以及细胞上清液中病毒量明显低于对照组；而沉默CSN6时,细胞以及细胞上清液中病毒量则高于对照组。这说明CSN6能有效抑制病毒复制；为了进一步确定内源性CSN6对ALV病毒复制的抑制作用,我们沉默CSN6后感染病毒,不同时间提取细胞基因组,检测整合入宿主基因组中病毒cDNA水平,结果发现沉默CSN6后整合在宿主基因组中病毒cDNA含量显著增加。 蛋白质泛素化修饰是一种非常重要的蛋白质翻译后修饰,它参与众多细胞内生物学过程。本实验通过对ALV多种病毒蛋白进行泛素化检测,结果发现ALV的Gag、IN和RT蛋白可以发生泛素化修饰。鉴于IN在该病毒复制过程中的重要作用,我们以ALV IN作为研究对象进一步研究,发现ALV IN的催化中心是其发生泛素化修饰的主要结构域,并且这一泛素化修饰不依赖于赖氨酸残基：相同现象我们在另一反转录病毒HIV的IN上也得到证实：进一步研究发现,ALV IN的锌指结构会影响其泛素化水平；经MS鉴定,ALV INT10和C38是其发生泛素化修饰的位点。 综上所述,我们筛选到了一种能与ALV IN相互作用的宿主蛋白CSN6,对其功能研究发现CSN6可以通过其C端直接与ALV IN催化中心结合,从而影响了病毒cDNA在宿主基因组的整合,并最终抑制了病毒粒子的产生。我们的研究结果表明宿主蛋白可直接靶向反转录病毒整合酶并抑制病毒的复制,为治疗反转录病毒提供了新思路：同时,我们发现ALV IN能够发生不依赖于赖氨酸残基的泛素化修饰,这种修饰如何影响病毒IN活性和病毒复制,以及发生泛素化修饰时所需要的泛素结合酶E2和泛素连接酶E3还需要进一步的研究。

【关键词】：
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【目录】：

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