组蛋白去乙酰化酶参与ERF转录因子调控的香蕉果实成熟机制研究

发布时间：2018-08-01 11:11

【摘要】：香蕉是呼吸跃变型果实,成熟启动后果实迅速软化,给贮运保鲜带来很大困难。许多研究表明,ERF转录因子和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)在植物的生长发育过程中发挥着重要作用。我们前期的研究发现,与成熟密切相关的MaERFs不仅可以反馈调控乙烯合成基因MaACS1和MaACO1,而且可以与MaACO1蛋白相互作用,从而参与香蕉果实成熟过程的转录调控。然而,HDAC是否参与以及怎样参与ERF调控香蕉果实成熟机制目前并不清楚。本文在明确MaERF11参与香蕉果实成熟的基础上,通过通过凝胶组织迁移实验(EMSA)、双荧光素酶报告基因实验(DLR)、蛋白互作技术和染色质免疫共沉淀(ChIP)等多种实验手段深入研究了HDAC参与ERF调控香蕉果实成熟机制,我们的研究结果拓宽了果实成熟的转录调控网络,尤其是在组蛋白去乙酰化修饰参与调控果实成熟机制方面加深了人们对果实成熟及其调控机制的认识。本文获得的主要研究结果和结论如下:1.MaERF11具转录抑制活性,它可以结合乙烯合成基因MaACO1和3个果实软化相关基因MaEXP2/7/8的启动子,进而参与调控香蕉果实的成熟过程。EMSA和ChIP实验表明,MaERF11可以结合乙烯合成基因MaACO1和3个果实软化相关基因MaEXP2/7/8的启动子。另外,DLR检测结果显示,MaERF11具有转录抑制活性,能抑制下游基因MaACO1和MaEXP2/7/8的启动子活性。这些结果说明,MaERF11作为转录抑制子,可以通过对乙烯合成基因MaACO1和果实软化相关基因MaEXP2/7/8的抑制作用来调控乙烯的合成和果实的软化。2.成熟相关基因MaACO1和MaEXP2/7/8的表达及其组蛋白乙酰化水平变化与果实成熟密切相关。荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示,MaACO1和MaEXP2/7/8基因的表达在采后香蕉后熟进程中均呈现不同程度的上升趋势。ChIP结果显示,成熟香蕉果实的MaACO1和MaEXP2/7/8基因染色质上的组蛋白H3和H4的乙酰化水平会高于未成熟的香蕉,这与基因的表达趋势相吻合。这些结果说明,MaACO1和MaEXP2/7/8的表达及其染色质上组蛋白的乙酰化水平与香蕉果实成熟密切相关。3.MaERF11通过招募MaHDA1形成转录抑制复合体,共同调控MaACO1和MaEXP2/7/8的转录表达。酵母双杂交(Y2H)、双分子荧光互补(BiFC)和免疫共沉淀(Co-IP)的结果均说明MaERF11与MaHDA1之间存在相互作用关系,并且,MaHDA1具有HDAC保守域和组蛋白去乙酰化酶活性,可以增强MaERF11对下游靶基因MaACO1和MaEXP2/7/8的抑制作用。这些结果共同说明,MaERF11与MaHDA1可以形成转录抑制复合体,共同调控后熟相关基因MaACO1和MaEXP2/7/8的表达,从而参与调控香蕉果实的后熟衰老过程。4.从香蕉基因组序列中获得了17个MaHDACs基因,可以分为RPD3/HDA1、HD2和SIR2三个不同亚族,并且它们在香蕉果实后熟过程中呈现不同的表达模式。我们从香蕉基因组中鉴别出17个MaHDACs基因,通过进化树关系和氨基酸序列保守域分析发现,其中的MaHDA1-12编码的氨基酸序列都包含一个HDAC保守结构域,属于RPD3/HDA1亚家族;MaHDT1-3编码的氨基酸序列在N端都有一个MEFWG保守域,属于HD2亚家族;而MaSRT1/2编码的氨基酸序列都有一个SIR2保守域,属于SIR2亚家族。qRT-PCR分析结果显示,17个MaHDACs在香蕉果实后熟进程中呈现出不同的表达模式,其中,尤以MaHDA6的表达变化最明显,在三个不同处理的香蕉果实中均表现出明显的上调趋势。5.探讨了MaHDA6在乙烯信号转导和果实成熟中的调控机制。研究表明,MaHDA6定位于细胞核内,具有组蛋白去乙酰化酶活性,ChIP结果显示,MaHDA6可以结合MaERF11/15的启动子,并且成熟香蕉果实的MaERF11/15基因染色质上组蛋白乙酰化的水平低于未成熟的香蕉,这与它们的表达是一致的。这些结果说明,MaHDA6可能通过去乙酰化作用来调控下游基因MaERF11/15的表达,从而参与调控乙烯信号转导途径和香蕉果实的后熟衰老。
[Abstract]:Bananas are respiratory climacteric fruits, and the fruits are rapidly softened after they are started. Many studies have shown that ERF transcription factors and histone deacetylase (HDAC) play an important role in the growth and development of plants. Our previous studies have shown that MaERFs, which is closely related to maturity, can not only be used for feedback. Regulate the ethylene synthesis gene MaACS1 and MaACO1, and interact with MaACO1 protein to participate in the transcriptional regulation of banana fruit ripening. However, it is not clear whether HDAC participates in and how to participate in ERF regulation of banana fruit ripening. EMSA, double luciferase reporter gene experiment (DLR), protein interaction technique and chromatin immunoprecipitation (ChIP) were used to study the mechanism of HDAC participation in the regulation of banana fruit ripening. Our results widened the transcriptional regulation network of fruit ripening, especially in histone deacetylation repair. The main research results and conclusions obtained in this paper are as follows: 1.MaERF11 has the transcriptional inhibitory activity, which can combine the MaACO1 of ethylene synthesis gene and the promoter of 3 fruit softening related genes MaEXP2/7/8, and then participate in the regulation of banana fruit. The actual maturation process.EMSA and ChIP experiments showed that MaERF11 could combine the ethylene synthesis gene MaACO1 and the promoter of 3 fruit softening related genes MaEXP2/7/8. In addition, DLR tests showed that MaERF11 had transcriptional inhibitory activity and could inhibit the activity of the promoter of the downstream gene MaACO1 and MaEXP2/7/8. These results suggest that MaERF11 is transcribed as a transcript. Suppressor, the expression of ethylene synthesis and fruit softening.2. maturity related genes MaACO1 and MaEXP2/7/8 can be regulated by the inhibition of ethylene synthesis gene MaACO1 and fruit softening related gene MaEXP2/7/8, and the changes in histone acetylation level are closely related to fruit maturity. Fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR) results show that MaACO1 The expression of MaEXP2/7/8 gene in the post harvest banana ripening process showed an increasing trend in the process of post harvest banana ripening..ChIP results showed that the levels of histone H3 and H4 on the MaACO1 and MaEXP2/7/8 chromatin of mature banana fruit were higher than those of immature bananas, which coincided with the trend of gene expression. These results indicate that MaACO1 The expression of MaEXP2/7/8 and its chromatin histone acetylation level are closely related to the ripening of banana fruit..3.MaERF11 is used to form a transcriptional inhibition complex by recruiting MaHDA1 to regulate the transcriptional expression of MaACO1 and MaEXP2/7/8. Yeast two hybrid (Y2H), bimolecular fluorescence complementation (BiFC) and immunoprecipitation (Co-IP) result in MaERF There is a interaction between 11 and MaHDA1, and MaHDA1 has the HDAC conserved domain and histone deacetylase activity, which can enhance the inhibitory effect of MaERF11 on the downstream target gene MaACO1 and MaEXP2/7/8. These results show that MaERF11 and MaHDA1 can form a transcriptional inhibition complex and jointly regulate the back ripening related genes MaACO1 and MaEXP. The expression of 2/7/8, thus participating in the regulation of banana fruit ripening and senescence,.4. obtained 17 MaHDACs genes from the banana genome sequence, which can be divided into three different subgroups of RPD3/HDA1, HD2 and SIR2, and they present different expression patterns in the process of banana fruit ripening. We identified 17 MaHDACs genes from the banana genome. Through the evolutionary tree relationship and the conservative domain analysis of amino acid sequences, it is found that the MaHDA1-12 encoded amino acid sequences all contain a HDAC conservative domain, belonging to the RPD3/HDA1 subfamily, and the MaHDT1-3 encoded amino acid sequence has a MEFWG conservative domain at the N end, which belongs to the HD2 subfamily; and MaSRT1/2 encoded amino acid sequences have a SIR sequence. The 2 conservative domain, belonging to the.QRT-PCR analysis of the SIR2 subfamily, showed that 17 MaHDACs showed different expression patterns in the ripening process of banana fruit, in which the expression of MaHDA6 was most obvious, and all of the three different treated banana fruits showed obvious up-regulated.5., which discussed MaHDA6 in ethylene signal transduction and fruit formation. The study shows that MaHDA6 is located in the nucleus and has the histone deacetylase activity. The results of ChIP show that MaHDA6 can combine the promoter of MaERF11/15, and the level of the histone acetylation of the MaERF11/15 gene of the mature banana fruit is lower than that of the immature banana, which is in accordance with their expression. These results suggest that MaHDA6 may be used to regulate the expression of the downstream gene MaERF11/15 by deacetylation, thus participating in the regulation of ethylene signal transduction pathway and the ripening senescence of banana fruit.
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S668.1

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本文编号：2157383