CMV诱导烟草内质网应激及调控因子NbbZIP28的研究

发布时间：2018-10-21 12:47

【摘要】：病毒侵染产生的大量病毒蛋白阻碍细胞转运功能,未/错折叠蛋白在内质网腔蓄积导致内质网应激(ER stress),诱发细胞防卫信号未折叠蛋白应答(UPR),或导致细胞程序性死亡(PCD)。有研究表明植物病毒通过调控UPR信号完成侵染复制,寄主会以PCD主动消亡的方式抵御病毒。但不同病毒调控UPR的信号机制及信号强弱尚不明确,寻找UPR和PCD的关键调节子,是抗病毒研究的重要方向。为此本文开展了 CMV诱导烟草ER stress及调控因子NbbZIP28的研究。首先,采用苗期接种鉴定法筛选抗CMV烟草资源,供试的3000余份烟草种质多表现中感和高感,获得1份中抗材料。CMV经PEG提纯和介导侵染烟草悬浮细胞BY-2,伊文斯兰染色鉴定细胞存亡。结果显示:CMV侵染悬浮细胞后48-72 h,细胞死亡率显著高于对照PBS,72 h达到90-100%;侵染原生质体后24 h导致原生质体完全解体。因不易区分自然凋亡的细胞和被病毒侵染的细胞及继代问题,故采用病毒-植株体系研究ER stress。为明确利用液泡膜复制的CMV是否诱导寄主ER stress,在CMV-IB侵染三生烟或本氏烟体系中,采用qRT-PCR检测ERstress相关基因的表达量,显示接种 CMV 后约 12-48 h,ER stress 相关基因显著上调。ER mark(mCherry-HDEL)瞬时转染48 h后激光共聚焦观察ER形态,发现接种CMV后5-10 d,ER膜结构发生了明显的重排和增生。电镜观察发现病变细胞叶绿体降解、线粒体肿胀,且沿液泡膜的微自噬和细胞质中的巨自噬结构增多。上述结果表明CMV侵染通过激活ER stress基因、改变ER膜形态和产生细胞自噬而诱导寄主细胞ER stress。其次,研究表明ER stress相关的UPR是细胞内的保守防卫反应,拟南芥AtbZIP28是ER stress诱导剂衣霉素诱导的UPR信号分子。为明确病毒侵染应激下的NbbZIP28信号,采用RACE和同源克隆鉴定基因,NbbZIP28-GFP、NbbZIP28ΔC-GFP和mCherry-HDEL瞬时转染及细胞核DAPI染色亚细胞定位蛋白。结果显示,NbbZIP28编码一个812个氨基酸的C端含跨膜区TMD及N端含亮氨酸拉链bZIP结构域的膜蛋白。其前体蛋白定位于ER膜,去TMD及其后C端序列的截短蛋白定位于细胞核。采用VIGS体系沉默NbbZIP28并检测其对UPR信号和病毒侵染的调控作用。结果显示,本氏烟接种TMV或CMV后48h,NbbZIP28的转录水平显著提高。与野生型相比,NbbZIP28沉默植株无显著表型变化。在病毒侵染早期,沉默植株中病毒的积累量显著提高;UPR基因(包括NbbZIP28的下游靶基因BiP和NF-YC2)显著被抑制、后期逐渐恢复甚至提高。这显示NbbZIP28为病毒诱导的UPR信号调节子,但不是唯一调节子,在病毒侵染早期,通过激活UPR信号提高寄主防卫反应以抵御病毒。最后,为验证UPR信号分子NbbZIP28调控病毒侵染的作用,经Crispr-cas9基因编辑和烟草遗传转染创建本氏烟NbbZIP28敲除突变体。突变体在发芽率、植株性状上与野生型无显著差异。对病毒的敏感性检测显示,寄主接种病毒早期,突变体植株中病毒(TMV-GFP、CMV)的积累量较野生型显著提高。盐、旱胁迫处理种子,发现突变体与野生型无显著差异。上述结果表明,NbbZIP28为病毒侵染应激中的UPR调控因子,在病毒侵染早期,提高寄主基础防卫反应,延缓了病毒的侵染。
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【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S435.72

【参考文献】