棉花纤维伸长相关基因GbEXPA2和GbEXPATR的克隆及功能分析.doc 全文免费在线

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网友小博士近日为您收集整理了关于棉花纤维伸长相关基因GbEXPA2和GbEXPATR的克隆及功能分析的文档，希望对您的工作和学习有所帮助。以下是文档介绍：棉花纤维伸长相关基因GbEXPA2和GbEXPATR的克隆及功能分析1文献综述1.1植物细胞壁的研究细胞壁是区别动物和植物细胞的主要标志之一。它为植物的生长发育提供了支持力和保护,还为人类提供了大量的可再生能源(Cosgrove2005)。其主要由纤维素、半纤维素、果胶、细胞壁蛋白和木质素组成。根据细胞壁功能的不同分为两类:初生细胞壁和次生细胞壁。初生细胞壁是在细胞生长时合成;次生细胞壁是当细胞停止生长时在初生壁内壁沉积形成(al2010)。尽管细胞壁是由多种刚性的复合物组成,沉积在质膜的外围,但它们仍能为细胞的扩展提供充分的伸展性。纤维素是植物细胞壁的主要成分,是世界上量最大的生物高分子聚合物,它约占初生壁的20-30%,次生壁的50%以上。纤维素在不同植物细胞壁中的含量存在差异,成熟棉纤维细胞壁中的纤维素含量可高达95%以上。纤维素是由D-葡萄糖残基以β-1,4-糖苷键连接,简单、无分支的聚合物图1.1),连续的葡萄糖残基通过180°转向形成一条以纤维素二糖为重复单元的长链(Taylor2008)。每条葡萄糖链的分子量都不同,这可能是在其合成过程中造成。棉纤维次生壁纤维素的聚合度能达到c.14,000-15,000(Brett2000),但初生壁的聚合度较低,一般为c.8,000(Brown2004),到底是什么原因造成初生壁和次生壁纤维素聚合度不同,目前还是未知。多条平型排列的多糖链通过氢键缔合形成密度大的结晶区和密度小的无定型区,最终形成一条条独立的纤维素微纤丝(al2003)。.1.2棉花纤维和细胞壁棉花在植物学分类上属于锦葵科棉族棉属(Gossypium)。在长期的栽培和驯化过程中,棉花形成了两个二倍体栽培种:草棉(G.herbaceum)、亚洲棉(G.arboreum),和两个四倍体栽培种:陆地棉(G.hirsutum)、海岛棉(G.barbadense)。陆地棉产量约占世界棉花总产量的90%,海岛棉约占5~8%,亚洲棉约占2~5%,草棉已很少栽培(QinandZhu2011)。棉花在我国有长达两千多年的种植历史。到了近代,虽然化纤的使用量不断上升,但棉纤维本身吸湿、透气、保暖的优点使天然纤维制品仍受到广大消费者的青睐。棉纤维是纺织工业的重要原料,它品质的好坏直接关系到纺织产品质量和档次的高低。在很长一段时间,传统育种是纤维品质改良的重要手段。近年来,分子生物学研究领域的迅猛发展,给棉花纤维品质育种提供了新的思路和方法。随着科学技术的进步,将分子育种与传统育种相结合则是今后棉花育种的主要方向。棉纤维是世界上最重要的天然纺织纤维。它由胚珠外表皮细胞分化而来,是高度伸长、增厚、无分支的单细胞表皮毛(Haigleretal2012)。成熟的陆地棉纤维细胞长度一般为22-33mm,而海岛棉纤维则能达到60mm。陆地棉纤维细胞的直径在11-22μm的范围内,因此,就陆地棉而言纤维细胞的长度是其直径的1,000-3,000倍(KimandTriplett2001),而海岛棉纤维细胞的长度与直径的比值将更大。Haigler等(2012)将纤维的发育分为纤维起始期(initiation)、纤维伸长期(elongation)、纤维初生壁向次生壁转换期(transition)、纤维次生壁合成期(secondarywallbiosynthesis)和纤维脱水成熟期(maturation)五个彼此重叠的时期图1.6)。.2实验材料与方法2.1实验材料2.1.1植物材料本研究中所用到的棉花材料有:陆地棉(Gossypiumhirsutum)标准系TM-1(TexasMarker-1),陆地棉品系YZ1、徐州142(Xu142),陆地棉野生种玛利加朗特棉(G.hirsutumracemarie-galante)、莫利尔棉(G.hirsutumracemorrlli);海岛棉(Gossypiumbarbadense)标准系3-79,海岛棉品系吉扎47(Giza47)、海7124(Hai7124),海岛棉半野生种离核木棉(G.barbadenseraceperuvianum)。以上材料均由本实验室提供,按照常规的耕作和管理每年在华中农业大学的实验地种植。其中陆地棉品系YZ1为本研究的遗传转化受体材料。开花当天在棉铃上挂牌,记为0DPA,以利于后续取所需纤维发育时间点的样品。本研究中所用到的拟南芥材料有:拟南芥Col-0型。拟南芥种植于光照培养室22℃,16h光照/8h黑暗)。.2.1.2实验菌株及载体本研究中所用到的菌株有:大肠杆菌Top10,农杆菌EHA105、LBA4404用于棉花转化)和GV3101用于拟南芥转化),均由本实验室提供。所用质粒为pDONR221、pGWB433和pGWB451。GbEXPA2和GbEXPATR的全长cDNA序列、启动子序列以及GbEXPA2和GbEXPATR超量表达载体、EXPA的RNAi载体均由本实验室涂礼莉博士提供(涂礼莉2007)。两个RNAi载体:一个抑制区域为GbEXPA2的3'UTR区,moncodingsequenceCDS,见图3.2A、C所示)。.2.2实验方法从已公布的二倍体棉花中棉(Ga,A2)和雷蒙德氏棉(Gr,D5)基因组数据库中获得全部expansin家族的序列(al2012;Lietal2014a)。本实验利用Circos软件对中棉和雷蒙德氏棉基因组中的expansin基因进行同线性基因对分析(thesyntenygenepairs;Krzywinskietal2009)。利用Genesis软件对两个棉种的expansin进行不同组织的表达分析聚类。以全长GhEX1(AF043284)序列为query,在TIGR的EST数据库中进行比对,共获得1,187条ESTs。这些ESTs数据用CAP3软件(HuangandMadan1999)进行组装。用Tablet软件对EST序列进行组装、排列,进而用于可视化SNP位点的分析。本研究中棉花基因组DNA的抽提采用植物基因组DNA提取试剂盒(DP305,TIANGEN,China)。取棉花新鲜幼嫩叶片约100-200mg,用DNA抽提缓冲液充分研磨,转入干净的2ml离心管中。根据试剂盒的操作步骤具体步骤参见Protocol1)进行后续实验,将吸附在吸附柱上的DNA用50-100μl的TE洗脱缓冲液溶解。取2μl的DNA样品在0.8%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。..3结果与分析............353.1GbEXPA2和GbEXPATR基因的结构及表达分析.......353.2GbEXPA2和GbEXPATR基因的进化分析.....393.3GbEXPA2和GbEXPATR的启动子分析.........463.4GbEXPA2和GbEXPATR在棉花纤维中的功能.........564讨论.........724.1关于棉花中expansin超家族的分析.......724.2关于GbEXPA2和GbEXPATR启动子的

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