Cf介导的ETI和针对稻白叶枯病菌的非寄主抗性的分子调控机理

发布时间：2018-10-31 16:58

【摘要】：根据所涉植物是否为所涉病原物的寄主,植物的抗病性可分为寄主抗性和非寄主抗性(nonhost resistance)。两类抗病性的产生机理既有许多共同点也有一些明显的区别。寄主抗性有病原相关分子模式触发的免疫(PAMP triggered immunity, PTI)和病原物效应蛋白触发的免疫(Effector triggered immunity, ETI)两个层次。番茄与叶霉菌(Cladosporium fulvum)的互作为典型的基因对基因(gene-for-gene)寄主抗性,番茄抗叶霉菌基因Cf介导产生对携带互补Avr基因的叶霉菌的ETI抗性。水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)寄主范围窄,在非寄主本氏烟(Nicotiana benthamiana)中诱导产生强烈的过敏性反应(hypersensitive response, HR)和非寄主抗性。本论文主要针对两个问题开展研究,首先,传统观念认为,介导产生ETI的植物抗病(resistance, R)基因不存在转录和转录后水平的基因表达调控。本论文通过对Cf介导的ETI研究发现,番茄Cf基因存在转录和转录后水平的调控；另外,本氏烟中Xoo诱导的HR和非寄主抗性产生机理尚不明确。本研究采用多种策略筛选鉴定该非寄主抗性调控基因,并明确了农杆菌对该非寄主抗性的抑制作用及机制。本研究获得了以下主要结果： 1.初步明确了番茄抗叶霉病基因Cf-4和Cf-9基因表达调控机理。分别从转录水平—DNA甲基化以及转录后水平—miRNA两个层次,对Cf-4和Cf-9基因表达调控机理进行了分析。在转录水平上,高温抑制Cf基因的表达,Avr强烈诱导Cf基因的表达,Cf-4的表达随着番茄植株株龄增加而升高,而Cf-9不受显著影响。启动子DNA甲基化参与高温抑制的以及常温下Avr9诱导的Cf-9基因的表达调控,另外在由高温到常温的降温过程中Avr4和Avr9对Cf-4和Cf-9基因表达的诱导作用可能受到甲基化的调控。采用VIGS技术,分析了番茄甲基化酶以及去甲基化酶基因对Cf基因表达的影响,发现番茄个别甲基化酶和全部4个去甲基化酶基因单独沉默显著改变Cf-4和Cf-9基因的表达,说明这些番茄甲基化酶和去甲基化酶基因可能参与对Cf表达的调控。在转录后水平,我们预测到了一条能够同时靶标Cf-4和Cf-9基因的长度为21nt的miRNA。通过该miRNA的靶标序列与前体序列共表达等分析,证实该miRNA能有效降解Cf-4和Cf-9mRNA。 2.筛选获得一批Cf-4/Avr4介导的HR的调控基因。通过差异表达蛋白对应基因的功能分析及本氏烟cDNA文库VIGS筛选,我们从500多个基因沉默结构中,筛选得到了28个参与调控Cf-4/Avr4介导的HR的基因,其中核糖核蛋白RNP、一个DNA结合蛋白和一个Dof锌指蛋白等正调控Cf-4/Avr4介导的HR,而一个环指蛋白、个含BTB/POZ和TAZ结构域蛋白、CP结合蛋白、SUMO结合酶SCE1、红色叶绿素代谢产物还原酶RCCR等22个蛋白负调控Cf-4/Avr4介导的HR。 3.建立和优化了本氏烟—Xoo非寄主抗性互作体系并研究明确H2O2积累是Xoo诱导的HR和非寄主抗性产生所必需。研究结果表明,用1×108cfu/ml的Xoo接种本氏烟完全展开的叶片,28℃下培养将产生最迅速最强烈的非寄主抗性。Xoo接种先在浸润区域内诱导活性氧大量积累,而后导致产生强烈的HR,并强烈诱导PR和HR标志基因的表达,最终导致Xoo的菌量急剧下降。采用过氧化氢酶清除H2O2的药理学实验结果表明,H2O2在Xoo诱导的HR和非寄主抗性中至关重要。 4.筛选获得一批Xoo诱导的本氏烟非寄主抗性调控基因。通过差异表达蛋白对应基因功能分析及本氏烟cDNA文库VIGS筛选,我们从500多个基因沉默结构中筛选获得了8个调控Xoo诱导的本氏烟HR的基因,其中碳酸酐酶、硫氧还蛋白h1以及核糖核蛋白是该HR的负调控因子,而丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、尿嘧啶特异的内切酶DnaJ同源亚家族基因成员、GTP结合蛋白以及三生烟中的硫氧还蛋白h这五个基因则为正调控因子。本氏烟核糖核蛋白基因同时参与Xoo诱导的HR和Cf-4/Avr4介导的HR的调控,但作用相反。 5.阐明了农杆菌对Xoo的抑菌作用以及对Xoo诱导的HR的抑制作用及其机制。结果显示,四种农杆菌菌株对Xoo诱导的HR的抑制作用有显著差异,菌株GV3101,EHA105和LBA4404能强烈抑制,但菌株C58C1无此作用。三种农杆菌对Xoo诱导的HR的抑制作用机制不同,菌株GV3101通过直接抑制Xoo的生长来抑制HR,该抑制作用需要Xoo中三型分泌系统基因hrcU和农杆菌Ti质粒pTiC58的参与。菌株LBA4404和EHA105则无直接抑菌作用,而是通过抑制本氏烟上活性氧的积累来抑制HR的产生。综上所述,本研究首次揭示了Cf-4和Cf-9基因表达在转录及转录后水平的调控作用及其机理,鉴定了首个调节Cf基因表达的miRNA。此外,利用cDNA文库VIGS筛选技术,从500多个基因沉默结构中筛选获得一批参与Xoo诱导的本氏烟HR和Cf-4/Avr4介导的HR的新调控基因。另外,首次揭示农杆菌对Xoo本身及其诱导的HR的抑制作用及其机理。这些研究结果增进对植物寄主ETI抗性和非寄主抗性产生机理的理解。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S432.2

【参考文献】