引起葡萄卷叶及环斑症状的病毒种类鉴定及其分子特性研究

发布时间：2018-11-14 07:20

【摘要】：葡萄病毒病是影响葡萄产量和品质的重要因素之一。葡萄病毒病种类很多,其中,葡萄卷叶病和葡萄扇叶衰退病在我国发生普遍,危害严重。葡葡卷叶病的典型症状为卷叶,由几种葡萄卷叶相关病毒(GLRa Vs)引起。而葡萄扇叶衰退病的症状表现复杂,类型多样,其中,引起环斑症状的相关病毒种类尚不明确。本研究对我国葡萄卷叶及环斑症状相关的病毒种类进行鉴定,并对相关病毒的分子特性进行研究。结果如下:1.我国葡萄样品中GLRa Vs的检测。本研究针对葡萄卷叶相关病毒1、4和7(Grapevine leafroll-associated virus-1,-4和-7,GLRa V-1、4和7)的CP和HSP70基因设计引物,研究建立了这几种病毒的]闶絉T-PCR方法,对来自14个省和自治区的100余份葡萄样品进行了检测。检测结果显示巢式RT-PCR具有较高的灵敏度,能够检测更多的病毒分离物。GLRa V-1,GLRa V-4和GLRa V-7在这些样品中的检出率分别为27.3%(36/132),43.2%(57/132),23.4%(44/188)。2.GLRa V-1、4和7中国分离物的遗传多样性分析。本研究共获得GLRa V-1中国分离物的43条CP和21条HSP70基因序列。系统进化树分析结果显示全球的GLRa V-1分离物的CP和HSP70基因序列分别划分为8个和7个组群,中国分离物分属于其中的5个和4个组群。CP基因进化树分析结果表明组4是一个新的组群。遗传进化分析结果显示属于CP基因组群2和8的变种是由于自然选择而非随机突变进化的结果。另外,在CP基因序列中发现3个新的重组序列。本研究获得了GLRa V-4的22条CP和19条HSP70基因序列,系统进化树分析结果显示GLRa V-4株系5、6、9、Pr和Car的变种形成各自独立的分支,而其他的GLRa V-4变种可划分为两个组群,一些中国分离物与其他几个国家的分离物划分为group1,包含日本分离物Ru1和Ru2的组群划分为group2。对HSP70基因序列的重组分析表明分离物LN-Ths4 clone3和HB-JF clone4为重组序列。本研究共获得GLRa V-7分离物的45条CP和16条HSP70基因序列,基因变异分析结果表明获得的CP基因序列的核苷酸/氨基酸的同源性为89.12%~100%/88.94%~100%,HSP70基因序列的核苷酸/氨基酸的同源性为85.33%~100%/88.97%~100%。系统进化树分析表明所有的CP和HSP70基因序列可分别划分5个和4个组群。CP和HSP70基因进化树中的组群3和4是两个新的组群。此外,CP基因序列的重组分析表明分离物LN-ZF clone9的CP基因序列为一个重组序列。3.一个新的双生病毒及两个新的GINV变种的基因组测定。对表现环斑症状的‘安尼斯基’、‘贝达’及健康的‘贝达’葡萄样品进行小RNA测序,发现了一个新的双生病毒及GINV的两个新变种。采用PCR扩增及滚环扩增方法对‘安尼斯基’中的双生病毒基因组进行扩增,确定双生病毒基因组全长为2905 bp。该基因组具有双生病毒特有的高度保守的核苷酸序列TAATATTAC,其ORFs(Open reading frames)预测结果显示该双生病毒包含7个ORFs,其中6个ORFS与已报道双生病毒的ORFs同源性为23%~67%。本研究表明该双生病毒为葡萄上发现的一个新病毒,由于它似乎不能引起葡萄明显的症状,故暂时命名为葡萄潜隐双生病毒(Grapevine latent geminivirus,GLGV)。本研究获得了两个中国GINV分离物LN_ANSJ_RS(Gen Ban K登录号:KU971246)和LN_BETA_RS(Gen Ban K登录号:KU234316),其与日本分离物(D88448)的RP基因的核苷酸/氨基酸同源性分别为71.02%/76.75%和71.29%/77.15%,CP基因的核苷酸/氨基酸同源性分别为78.91%/86.67%和80.27%/89.74%。中国分离物LN_ANSJ_RS和LN_BETA_RS之间RP和CP之间的核苷酸/氨基酸同源性为74.87%/82.09%,83.16%/94.36%。GINV与发状病毒属(Trichovirus)其他成员的RP、MP及CP基因的氨基酸进化树分析结果表明LN_ANSJ_RS、LN_BETA_RS及日本分离物处于GINV大分支上的3个不同的小分支上,为GINV的3个不同的变种。这是GINV在中国的首次报道。研究结果也初步表明GINV与环斑症状紧密相关。4.GINV的检测及遗传多样性分析。针对GINV分离物的MP和CP基因分别设计引物,对来自15个省和自治区的195个葡萄样品进行了PCR和巢式PCR检测,结果表明GINV总的检出率为35.9%(70/195)。属于13个品种的17个葡萄样品表现明显环斑症状,其GINV检出率为94.1%(16/17)。CP基因和MP基因序列的系统进化分析结果表明GINV分离物可划分为3个组群,其中组3仅由中国分离物LN-Beta2与日本分离物(D88448)组成,组1和组2为两个新发现的组群,仅由中国分离物组成。
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【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S436.631

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