圆锥铁线莲叶片响应紫外诱导机制及香豆素生物合成途径的系统性研究

发布时间：2018-11-20 10:24

【摘要】：药用植物体内的次生代谢产物通常是中药材发挥临床疗效的物质基础,也是评价药材质量的重要指标。植物药材中的大量天然活性成分是在逆境条件下产生和积累的。近年来,关于环境影响药材品质形成机制成为研究热点,目前大多数研究处于描述环境因子对药效成分积累的影响阶段,而阐明药材质量形成的机制报道较少。研究发现通过调节UV-B辐射剂量能显著提高药用植物中活性成分的含量,而UV-B影响药用植物代谢途径的机制,包括对基因调控和关键酶表达等,仅见黄酮类等少数成分的研究。我们从系统生物学的角度出发,分别应用代谢组学、转录组学和蛋白质组学技术,对圆锥铁线莲叶片应用高强度UV-B诱导和黑暗培养的响应机制进行了研究。结合qRT-PCR和酶学活性实验等技术阐明了次生代谢物香豆素生物合成的关键酶和关键底物,并推测出复杂香豆素的生物合成途径。本研究从整体上揭示了逆境条件下圆锥铁线莲叶片内各化学组分间的相互关系,阐明了药用植物次生代谢特异性响应的分子机制。本论文的主要研究内容和结果如下:(1)我们利用NMR,UPLC TOF-MS/MS和GC TOF-MS等技术对诱导前后圆锥铁线莲叶片的代谢物进行了定性定量分析。分析发现在高强度UV-B诱导后,主要为5个次生代谢物显著积累,而2个次生代谢物的含量显著减少,表明高强度UV-B诱导处理对圆锥铁线莲的影响主要体现在初生代谢水平上。而在高强度UV-B诱导后的黑暗培养阶段,有38个次生代谢物含量发生了显著的变化,其中有19个次生代谢物为响应胁迫处理特异合性成。这些代谢物主要属于脂肪酸类,内酯类,多酚类,苯甲酸类,香豆素类以及芪类。圆锥铁线莲叶片在高强度UV-B诱导后的黑暗培养阶段比高强度UV-B诱导阶段积累了更多的次生代谢物,同时在黑暗培养阶段次生代谢物的含量也显著增加,显示黑暗培养导致圆锥铁线莲叶片内发生了更加剧烈的扰动。(2)转录组学改变了单个基因分析的研究模式,它将基因组学研究带入高速发展的时代。我们应用差异转录组学技术对高强度UV-B诱导前后的圆锥铁线莲叶片进行了研究。通过Denovo拼接,我们得到了 103091条Unigene,其中长度在500 bp(含500 bp)以上的有29875条。我们对高强度UV-B诱导前后以及黑暗培养后的转录组表达谱进行了分析,结果显示次生代谢途径相关的Unigene数量在诱导及避光培养阶段依次上升。我们针对转录本表达谱中所涉及的次生代谢信息进行了深入研究。根据KEGG注释结果,最终分析发现包含Unigene最多的次生代谢途径为苯丙烷类,二苯乙烯类,黄酮和黄酮醇,莨菪烷类和异喹啉生物碱类。其中在苯丙烷代谢途径中,有54.4%的unigene在高强度UV-B诱导阶段上调表达,而在高强度UV-B诱导后的黑暗培养阶段有58.3%的unigene发生了上调表达,表明苯丙烷类代谢途径积极响应了高强度UV-B诱导和随后的黑暗培养胁迫。(3)为从整体上分析圆锥铁线莲叶片在高强度UV-B辐射和黑暗胁迫的代谢响应机制,我们对转录组、蛋白质组和代谢组数据进行了整合分析,以系统生物学的方法在代谢水平,转录组水平和蛋白质水平同时分析代谢网络的扰动情况,以期能够深入挖掘圆锥铁线莲叶片对高强度UV-B诱导及黑暗培养的响应机制。通过整合代谢组学和蛋白质组学数据,结果发现氨基酸代谢相关的代谢物的含量和蛋白质丰度在响应高强度UV-B诱导和黑暗培养阶段显著增加。聚类分析和KEGG代谢通路分析发现S-腺苷甲硫氨酸合成酶和半胱氨酸合酶的含量在逆境过程中是逐渐增加的,这些结果与验证实验结果说明高强度UV-B辐射显著提高了圆锥铁线莲叶片的抗氧化能力。同时,二氢硫辛酸脱氢酶,谷氨酸脱氢酶和γ-氨基丁酸的含量显著升高,表明高强度UV-B辐射增强了圆锥铁线莲叶片的活性氧清除能力,同时启动了 Y-氨基丁酸分流途径。通过对转录组和蛋白质组数据进行整合分析,发现转录后修饰,泛素蛋白酶体和核糖体蛋白等蛋白代谢相关的蛋白质和基因发生了显著变化。高强度UV-B辐射后,NADP依赖的苹果酸酶基因显著性上调表达,NADP-苹果酸脱氢酶蛋白含量明显增加,同时酶活性检测实验证明这两个酶的活性也显著增强。这些结果证明圆锥铁线莲叶片逆境耐受性因三羧酸循环途径的激活而显著增强。(4)NMR和UPLC TOF-MS/MS的分析结果表明,高强度UV-B诱导使圆锥铁线莲产生一系列的香豆素类化合物,包括线型吡喃香豆素和结构比较独特的简单香豆素。应用qRT-PCR,酶学活性实验,结合NMR和LC-MSMS等技术,最终确定了香豆素合成的关键酶及关键底物,并合理推测出了复杂香豆素的合成途径。(5)对叶绿体基因组的深入研究有助于理解细胞核基因组与叶绿体基因组之间的相互调节关系,从而在分子水平上揭示次生代谢合成途径激活的生物机制。我们利用二代高通量测序平台对圆锥铁线莲叶绿体基因组进行了大规模测序分析。结果显示圆锥铁线莲叶绿体基因组全长159,528 bp,呈典型的四段式结构,其中LSC区长79,327bp,SSC区长18,111 bp,两个反向重复区长31,045 bp。圆锥铁线莲叶绿体基因组共有137个具有编码能力的功能基因。在已测序的毛茛科物种中,圆锥铁线莲叶绿体基因组的SSC区是最小的。对五种毛茛科的叶绿体基因组序列进行的比较分析发现圆锥铁线莲叶绿体基因组编码区的序列比非编码区更加保守。分析还发现圆锥铁线莲叶绿体基因组在LSC区存在三个倒置区域,同时圆锥铁线莲和十大功劳的JLB和JLA处有较大的扩张。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S567.19

【参考文献】