【摘要】：棉铃虫(Helicoverpa armigera Hubner)是一种危害广泛的世界性的重要害虫。化学防治是害虫治理的一项重要措施,随着杀虫药剂的大量使用,已有研究表明棉铃虫对多种杀虫药剂产生不同程度的抗性。目前关于抗药性的研究主要集中于解毒代谢的改变和分子靶标的变异,但是杀虫药剂的许多靶标位于细胞膜上或细胞内,关于药剂如何穿透细胞膜以及害虫本身如何快速降低细胞内有毒物质的研究却相对很少。P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)是由多药耐药基因MDR1编码的一种跨膜糖蛋白,属于ABCB亚家族,通过消耗ATP主动将细胞膜内的有毒物质转运到细胞膜外,既保护组织免受外源性有毒物质和内源性代谢有毒物质的威胁,又一定程度上可以影响药物的吸收。细胞自噬(Autophagy)是细胞在自噬相关基因(Autophagyrelatedgene,Atg)的调控下利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程,普遍存在于所有细胞内,以维持细胞自身合成和降解的稳态,是生物体内十分重要的生物学现象之一。细胞自噬相关基因8(Autophagy related gene 8,Atg8)编码的蛋白是一种为自噬体膜形成所必需的泛素样的小蛋白,在控制自噬体膜延伸方面发挥着重要作用,也常用来作为自噬发生的一个鉴定标志。利用高通量转录组测序的方法得到了棉铃虫转录组文库,利用表达谱测序得到了棉铃虫不同发育阶段的表达文库和2-十三烷酮处理前后的数字基因文库。再通过生物信息学分析,筛选出了一条编码多药耐药相关蛋白(Multidrug resistant associate protein,MRP)基因。运用RACE基因克隆方法得到了棉铃虫P-糖蛋白基因的全序列4054bp,其开放阅读框总共编码1253个氨基酸,预计蛋白大小约137 kDa。运用荧光定量分析表明P-糖蛋白在整个发育阶段的表达中,在四龄幼虫时表达最高;在不同组织的定位表达中发现P-糖蛋白基因在头部组织和脂肪体组织中表达量高于其他组织。之后,分别用10 mg/g的2-十三烷酮、40 μg/g的阿维菌素、10μg/g的溴氰菊酯、LC10和LC90的氯虫苯甲酰胺诱导棉铃虫六龄幼虫,利用荧光定量明确P-糖蛋白的表达。在2-十三烷酮处理组中,诱导12 h后P-糖蛋白的表达量达到顶峰,之后在24 h时出现下降,在48 h表达趋于对照水平;在组织诱导表达中,发现P-糖蛋白在中肠中表达量最高。在阿维菌素处理组中,头部、脂肪体和中肠中P-糖蛋白的表达都是逐渐升高,且在48h表达量最高;而在体壁中P-糖蛋白的表达是逐渐降低,12h表达量最高,24 h后明显下降。在溴氰菊酯处理组中,P-糖蛋白在12 h表达量最高,且在四个组织中中肠的表达量最高;在48 h表达量相对最低。在LC10氯虫苯甲酰胺处理组中,P-糖蛋白表达量在24h出现最低值,48h表达量最高;在组织诱导表达中,P-糖蛋白在中肠和脂肪体表达量相对较高,而体壁表达量最低并且几乎不变。在LC90氯虫苯甲酰胺处理组中,P-糖蛋白在12 h表达量相对最高,在48 h表达量相对最低;在组织诱导表达中,P-糖蛋白在体壁中表达量最高,在中肠中表达最低。利用免疫组化研究同样发现,2-十三烷酮和阿维菌素都可以诱导P-糖蛋白在棉铃虫细胞中表达增加。运用RNAi干扰P-糖蛋白基因发现,相对对照组,棉铃虫死亡率显著升高。通过克隆棉铃虫Atg8基因全长cDNA序列为727 bp,其开放阅读框总共编码117个氨基酸,预计蛋白大小约1.39kDa,pI值为8.73。运用荧光定量分析表明Atg8在整个发育阶段的表达中,成虫的表达量最高;在组织的定位表达中,头部表达量最高。之后,分别用10 mg/g的2-十三烷酮、40 μg/g的阿维菌素、10μh/g的溴氰菊酯、LC10和LC90的氯虫苯甲酰胺诱导棉铃虫六龄幼虫,利用荧光定量观察Atg8的表达。在2-十三烷酮处理组中,Atg8在四个组织中的表达在24 h达到峰值。在阿维菌素处理组中,Atg8的表达是逐渐升高,且在四个组织中的表达在48 h达到峰值。在溴氰菊酯处理组中,头部、脂肪体、中肠中Atg8的表达量在24 h达到峰值,但是在体壁中的表达却和对照组差异不大。在LC10氯虫苯甲酰胺处理组中,Atg8的表达量在处理后24 h达到峰值,且在体壁和中肠的表达量较高。在LC90氯虫苯甲酰胺处理组中,Atg8表达量在24 h达到峰值,且在脂肪体中表达量最高。运用RNAi干扰Atg8基因,结果发现相比对照组,棉铃虫死亡率显著升高。本文从P-糖蛋白和自噬相关基因8这两方面研究不同外源有毒化合物对棉铃虫P-gp和Atg8的诱导表达作用,结果表明P-gp和Atg8对外源有毒物质的耐药性发挥了重要的作用,从一个新的角度阐明了昆虫的抗药性机制,为揭示害虫的多抗性机制提供新的思路。
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【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S433
【参考文献】
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9 ;Comparison of Acetylcholinesterase Characteristics Between Resistant and Susceptible Strains of Helicoverpa armigera (Hübner)[J];Agricultural Sciences in China;2005年12期
10 陈波,金锋,卢香兰,王萍萍,刘云鹏,王舒宝;PKC抑制剂对MGC803细胞中P-gp表达及耐药性的影响[J];癌症;2004年04期
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2369640
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