木麻黄青枯病的抗性鉴定及EST-SSR关联分析

发布时间：2019-01-04 14:58

【摘要】：木麻黄科(Casuarinaceae)植物原产澳大利亚和太平洋岛屿,包括4属86种13亚种,“木麻黄”是该科植物的统称。由于具有抗风、抗旱、耐盐碱、速生的特点,被广泛用于防风固沙、盐碱地改良和干旱区造林。我国引种木麻黄有近百年历史,现已成为广东、广西、福建、台湾及南海诸岛沿海防护林的主栽树种。由于少量无性系长期大面积种植,自2012年起,广东省木麻黄青枯病爆发并蔓延,严重摧毁了整个沿海防护林体系。木麻黄青枯病是由青枯菌(Ralstonia solanacearum)通过土壤传播引起,是世界范围内最难防治的细菌性重大病害之一,目前抗病育种被认为是防治木麻黄青枯病的根本途径。本研究在木麻黄青枯菌的分离与鉴定基础上,利用可靠有效的抗性鉴定方法对我国现有木麻黄种质资源开展青枯病抗性鉴定,研究木麻黄感染青枯病的生理变化,利用开发的235个EST-SSR标记分析了木麻黄核心种质的遗传多样性与群体结构,并开展了分子标记与抗病性状的关联分析,为木麻黄抗病分子辅助育种研究奠定了基础。通过以上研究,得到以下主要结论:(1)采用稀释分离法及根系溢出法在TTC培养基上共分离出了31个病原菌株。根系溢出法操作简便,杂菌含量低,分离率在60%左右,可作为常规稀释分离法的补充。31个菌株进行16s rRNA测序鉴定,有22个菌株扩增出了特异性条带并经测序比对确定这22个菌株为青枯菌。青枯菌株致病性测定结果显示菌株致病性在无性系间、菌株间及菌株与无性系间的交互作用均具有极显著差异(P0.01)。相关分析表明,不同接种方法间菌株致病性具显著相关(P0.05)或极显著相关(P0.01),相关系数值(r)介于0.497~0.731之间。选择在不同无性系及不同接种方法中均具有较强致病性的GL-2、H、M、TC-1、F、Q菌株作为木麻黄种质资源抗性鉴定试验菌株。(2)以木麻黄无性系A8为试验材料,设计8种人工接种方法,系统探讨了水培生根苗、嫩枝、绿梗小枝、褐梗小枝、青枯菌粗毒素及盆栽小苗伤根接种、盆栽小苗无伤接种等不同接种方法对木麻黄青枯病抗性鉴定的影响,试验表明,盆栽幼苗伤根接种及褐梗小枝室内水培接种是木麻黄青枯病抗性鉴定较好方法,能够有效区分木麻黄抗、感无性系,这两种方法鉴定结果呈极显著正相关(r=0.857),可靠性强;盆栽幼苗不伤根接种及水培生根小苗、嫩枝室内水培接种不适宜作为木麻黄青枯病抗性鉴定方法,绿梗小枝与青枯菌粗毒素室内水培接种也不是优选方法。利用褐梗小枝室内水培接种法,对53份木麻黄育种材料进行抗性评价,筛选出X1、45、平5、30、W6、杂交、501、G1、503、41、A1及A1-3等12份高抗材料。(3)采用幼苗伤根接种法接种木麻黄强致病性青枯菌,研究侵染前后木麻黄功能小枝中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)等防御酶活性及可溶性蛋白含量的变化规律,考察各指标的抗病响应规律。结果表明:接种后木麻黄A8无性系防御酶活性发生了显著变化,青枯菌诱导了SOD、PPO、PAL酶活性的增加,表现出“升-降-升-降”的变化趋势,在植株枯萎死亡前,酶活性下降。相反,青枯菌抑制了木麻黄A8无性系CAT、POD的活性,酶活性明显低于对照处理。此外,接种后植株可溶性蛋白的含量也增加,其含量变化与SOD、PPO和PAL酶活性变化趋势基本一致。(4)利用NCBI网站上的37902条木麻黄茎组织转录组序列,得到含有SSR位点的序列有3861条,搜索获得4187个SSR位点,检出率为10.2%,平均8.3 kb出现1个SSR位点。二核苷酸和三核苷酸重复基元在所检出的SSR位点中占主导地位,分别占总数的39.5%和24.2%;二核苷酸重复基元以AG/CT为主导,三核苷酸重复基元以AAG/CTT为主导;二核苷酸重复基元以6、7、8次重复为主,五核苷酸与六核苷酸以3、4重复为主。设计合成引物404对,有235对能有效扩增,其中151对引物所在的EST序列与已知基因同源,其功能可归入到生物学过程、分子功能和细胞组件等3大类36亚类上,许多序列涉及多重功能;新开发235个标记在木麻黄4个树种中通用性良好,缺失程度(DD)均小于5%,其中223个具有丰富的多态性,平均观测杂合度(HO)为0.8558,平均期望杂合度(HE)为0.7243,平均等位基因数5.4个,平均PIC值为0.63;参试木麻黄核心种质资源遗传距离平均为0.5523,在遗传距离0.30处将63个无性系分为三大组。(5)利用235对EST-SSR标记对我国现有的木麻黄种质资源进行了基因组扫描,共获得在抗感基因池差异表达标记49个。该群体由2个亚群组成,亚群的划分与材料的地理来源没有必然联系,群体结构比较简单,遗传变异较为丰富,适于遗传关联分析。利用MLM(Q+K)模型通过关联分析共检测到10个标记(CeSSR253、CeSSR022、CeSSR359、CeSSR241、CeSSR242、CeSSR056、CeSSR263、CeSSR052、CeSSR176及CeSSR258)与供试群体青枯病抗病指数显著关联(P0.05),对表型变异解释率为12.6%~60.7%,初步推断这些标记可能与某个贡献率较大的抗病/易感位点连锁。CeSSR052-237bp及CeSSR052-255bp这两个等位片段在木麻黄青枯病抗性中有最大增效效应(37.1)和表型效应比(70.1%),CeSSR359-370bp、CeSSR359-386bp、CeSSR241-265bp等抗性关联位点-等位片段的抗性增效效应均在20.0以上;CeSSR022-190bp、CeSSR022-196bp等位片段抗病指数减效效应均大于40.0,表型效应比均大于40%,CeSSR253-186bp、CeSSR253-202bp、CeSSR242-227bp、CeSSR176-204bp等抗性关联位点-等位片段的抗性减效效应均在20.0以上。
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【学位授予单位】：中国林业科学研究院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S763.7

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