植物乳杆菌调节猪肠上皮细胞屏障功能和转运载体的研究

发布时间：2019-02-18 09:35

【摘要】：本论文旨在研究植物乳杆菌(LP)对感染产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic E.coli,ETEC)K88的肠上皮细胞(IPEC-J2)屏障功能、转运载体表达及免疫反应的影响。试验分成3个部分:试验一:1)选取不同浓度ETEC K88(MOI=10、25、50、75和100)攻毒IPEC-J2细胞不同时间(1、2、3和4 h),通过测定细胞存活率、IL-6、IL-8及TNF-α的mRNA表达,确定ETEC-K88的最佳攻毒浓度和时间,建立ETEC K88-IPEC-J2互作模型;2)选取不同浓度的LP(MOI=10、25、50、75和100)预处理IPEC-J2细胞不同时间(3、6和9 h)并攻毒,通过测定细胞存活率、IL-6、IL-8及TNF-α的mRNA表达,确定LP的最佳处理浓度和时间,建立LP-IPEC-J2互作模型;3)通过测定细胞培养上清中IL-8及TNF-α的含量,确定LP-IPEC-J2-ETEC K88互作模型。结果表明:1)与对照组相比,ETEC K88(MOI=50)攻毒IPEC-J2细胞3 h后,细胞中促炎性因子IL-6、IL-8及TNF-α的mRNA表达显著上调(P0.05);因此,确定ETEC K88与IPEC-J2互作的最佳模型为MOI=50,培养时间3 h;2)与ETEC K88对照组相比,LP(MOI=75)预处理IPEC-J2细胞6 h后,细胞中促炎性因子IL-6、IL-8及TNF-α的mRNA表达显著下调(P0.05);因此,确定LP与IPEC-J2互作的最佳模型为MOI=75,培养时间为6 h;3)与对照组相比,ETEC K88(MOI=50)攻毒IPEC-J2细胞3 h后,细胞培养上清中IL-8及TNF-α的含量显著升高(P0.05),而与ETEC K88组相比,LP预处理后,细胞培养上清中IL-8及TNF-α的含量显著降低(P0.05);综上,我们确定ETEC-IPEC-J2-LP互作模型为:LP(MOI=75,约为1×108 CFU)预处理IPEC-J2细胞6 h后,再进行ETEC K88(MOI=50,约为6.5×107 CFU)攻毒IPEC-J2细胞3 h。试验二:将IPEC-J2细胞接种于与Transwell 6孔板,细胞分化后(约为1.3×106个/孔),在试验一确定的互作模型条件下,对细胞进行LP预处理和ETEC K88攻毒,之后收集细胞并保存待测定。试验中,未做任何处理的细胞定为对照组,单独做LP预处理的细胞定为LP组,单独做ETEC K88攻毒的细胞定为K88组,LP预处理后进行攻毒的细胞定为LP+K88组,每组共6个重复(孔)。结果表明:1)与对照组相比,eteck88攻毒后,ipec-j2细胞teer值显著下降(p0.05);细胞中紧密连接claduin-1、occludin、zo-1的mrna表达(p0.05)及claudin-1及occludin的蛋白表达显著下降(p0.05);与k88组相比,lp预处理后能够显著抑制eteck88诱导的细胞teer值的下降(p0.05)、抑制eteck88诱导的细胞中claudin-1、occludin、zo-1的mrna表达(p0.05)及occludin蛋白表达的下降(p0.05);激光共聚焦的结果与上述结果一致,表明eteck88能够破坏紧密连接claudin-1及occludin的表达,而lp预处理可以缓解eteck88对ipec-j2细胞紧密连接的破坏。2)与对照组相比,eteck88攻毒后,ipec-j2细胞中葡萄糖转运载体sglt1、氨基酸转运载体y+lat1、cat1和asct2的mrna表达均显著下调(p0.05)、氯离子转运载体cftr及nkcc1的mrna表达均显著上调(p0.05);与k88组相比,lp预处理后能显著抑制ipec-j2细胞中上述葡萄糖及氨基酸转运载体的mrna表达的下调(p0.05)、抑制细胞中上述氯离子转运载体mrna表达的上调(p0.05);无论是lp预处理还是k88攻毒均对细胞中葡萄糖转运载体glut2、sglt3及氨基酸转运载体cat2、b0,+at的mrna表达无显著影响(p0.05)。3)与对照组相比,eteck88攻毒后,ipec-j2细胞中促炎性细胞因子il-1β、il-6、il-8及tnf-α的mrna表达显著上调(p0.05),而抗炎性细胞因子tgfβ及ppar-γ的mrna表达显著下调(p0.05);ipec-j2细胞中tlr1、tlr2、tlr6、tlr9的mrna表达及tlr2的蛋白表达显著下调(p0.05),而tlr5和tlr7的mrna表达显著上调(p0.05);细胞中tlr负调控因子sigirr、bcl3和mkp-1的mrna表达显著下调(p0.05)。与k88组相比,lp预处理后,能够抑制促炎性细胞因子il-1β、il-8及tnf-α的mrna表达的上调(p0.05),抑制抗炎性细胞因子tgfβ及ppar-γ的mrna表达的下调(p0.05),抑制eteck88诱导的tlr4、tlr5和tlr7的mrna表达的升高及tlr2mrna和蛋白表达的降低(p0.05),抑制eteck88诱导的sigirr、bcl3和mkp-1的mrna表达的下调(p0.05)。此外,lp单独预处理细胞后,能够显著上调细胞中ppar-γ、tlr6及bcl3的mrna表达(p0.05)。无论是lp预处理还是k88攻毒处理细胞后,细胞中tlr3、tollip、a20及irak-m的mrna表达均无显著变化(p0.05)。试验三:将ipec-j2细胞接种于与transwell6孔板,细胞分化后(约为1.3×106个/孔),将lp(1×108cfu/well)与细胞于37°c、5%co2培养箱中共培养6h后,去除培养上清并用PBS清洗细胞。之后用ETEC K88(MOI=50,约为6.5×107CFU)攻毒细胞。在37°C、5%CO2培养箱中分别培养0、12、25和50 min后,去除培养上清,PBS清洗细胞。之后收集细胞并测定P38、p-P38及IκBα的蛋白表达。试验中单独做ETEC K88攻毒的细胞定为K88组,LP预处理后进行攻毒的细胞定为LP+K88组,每组共6个重复(孔)。结果表明:与K88组相比,K88攻毒12、25及50 min后,LP预处理的细胞中IκBα的蛋白表达显著增加(P0.05);K88攻毒25 min和50 min后,LP预处理的细胞中p-P38的蛋白表达显著降低(P0.05),即表明LP可以一定程度上抑制ETEC K88诱导的NF-κB和MAPK信号通路。综上所述,LP预处理能够缓解ETEC K88诱导的促炎性因子的表达上调及抑炎性因子表达的下调,进而通过维持肠上皮细胞紧密连接mRNA及蛋白表达、维持肠道氨基酸转运载体、葡萄糖转运载体及下调氯离子转运载体mRNA表达,发挥保护肠上皮细胞屏障功能及营养物质转运功能的作用。LP这种保护作用的发挥可能是通过调节TLRs、NF-κB和MAPK信号通路来实现的。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.28

【参考文献】