miR168启动子功能特异性解析及microRNA在苹果果皮着色过程中的功能研究

发布时间：2019-05-07 02:53

【摘要】：microRNAs是一类广泛分布于植物基因中的非编码小分子RNA,它通过与靶基因结合后裂解或抑制靶基因mRNA的翻译,在基因转录后水平上调控植物生长、发育、胁迫响应等,是植物基因表达的重要调节因子。miR168序列在不同植物物种中具有高度保守性,通过调控目标基因AGO1的表达进而间接调控所有miRNA的表达,但miR168在不同物种植物中执行的功能是否一致尚未见报道。本研究以葡萄、杨树、拟南芥等为试材,通过比较分析miR168启动子顺式元件的数量、位置、功能等,揭示miR168启动子功能在葡萄和模式植物进化中的变化,为miR168在果树上的研究拓展领域。苹果套袋能明显改善果皮色泽,前人的研究表明套袋影响了苹果花青苷生物合成途径中基因在转录水平上的表达,而基因在转录后水平上的调控尚未见报道。本试验以套袋和未套袋的‘澳洲青苹’苹果为试材,研究套袋对苹果果皮miRNA表达水平的影响,以探究基因转录后水平上苹果果皮着色的分子调控机制,为苹果果实着色机理研究提供依据。本研究获得的主要结果如下:(1)对果树中miRNA的序列比较发现,果树中保守miRNA,miR477、miR482和miR3627相同家族的miRNA的序列存在一定水平的差异,且其保守程度低于植物中保守miRNA,miR168、miR156和miR172,其中miR168为属于高保守miRNA家族。(2)在葡萄、杨树、拟南芥基因组中分离获得4条序列长度为2-2.3kb的miR168启动子,其中葡萄、杨树、拟南芥基因组中分别有1条(pVitVinMIR168)、2条(pPopTriMIR168A和pPopTriMIR168B)和1条(pAraThaMIR168A)。利用PlantCARE生物信息学软件对miR168启动子顺式作用元件预测发现,保守元件G-box在不同物种植物miR168启动子序列中的分布情况不同,在葡萄pVitVinMIR168、杨树pPopTriMIR168A序列中均含有2个G-box保守元件,杨树pPopTriMIR168B序列中仅有1个G-box元件,拟南芥pAthAraMIR168A序列中有3个G-box元件。(3)不同物种植物miR168启动子的转基因拟南芥GUS组织染色结果显示,VitVinMIR168启动子驱动的GUS基因主要在拟南芥的初生叶、初生叶原基、子叶叶尖、子叶的叶脉、侧根尖和主根尖中表达,PopTriMIR168A启动子驱动的GUS基因表达部位与葡萄miR168启动子的表达部位只有一处不同,即在初生叶不表达而在侧根原基及下胚轴与根交界处表达,PopTriMIR168B启动子驱动的GUS基因在初生叶原基、主根尖和侧根原基及下胚轴与根交界处表达,AraAthMIR168A启动子仅在拟南芥的初生叶、子叶叶尖、子叶叶脉和初生叶原基处表达。结果显示,葡萄mi R168启动子和杨树miR168A启动子的表达模式相似,而与杨树miR168B启动子和拟南芥mi R168启动子的表达模式存在显著差异。(4)成功构建了AGO1m与pAraAthMIR168A:miR168m组成的表型互补载体,转入表型互补载体后,突变体AGO1的T1代转基因植株绝大部分恢复至野生型表型,只有9%的转基因植株缺陷型表型没有被完全恢复。AGO1m分别与pVitVinMIR168:athmiR168m、pPopTriMIR168A:athmiR168m、pPopTriMIR168B:athmiR168m构成三组表型互补载体,获得共转化的阳性转基因植株后,分析不同物种植物的miR168启动子对恢复AGO1m造成的植株发育缺陷的能力,结果表明葡萄miR168启动子功能与杨树miR168A启动子功能相近,而与杨树miR168B启动子和拟南芥miR168A启动子功能差异较大。(5)以解袋和未套袋‘澳洲青苹’苹果果皮为试材建立小RNA文库,经Illumina HiSeq 2000系统进行小RNA测序,分析得到由43个miRNA家族组成的201个已知的成熟mdm-miRNAs和220个新miRNAs,其序列长度以21 nt sRNAs为主(39.52%),其次是24nt sRNAs(17.83%)。解袋后苹果miRNA的表达量出现了明显的变化,解袋6h后苹果果皮21个miRNA的表达水平显著下调,3个mi RNA表达水平上调。对其中高表达miRNA进行目标基因预测,结果显示这些miRNA的功能主要与转录因子、热胁迫响应和抗氧化酶系统有关,表明套袋果实解袋后激活了苹果果皮的光保护机制。(6)针对mdm-miR156、mdm-miR828、mdm-miR858和miR5072这4种在调控花青苷生物合成中可能起重要作用的miRNA,利用实时定量RT-PCR技术,比较了绿色品种‘澳洲青苹’和红色品种‘新红星’在解袋后和未套袋处理下这4种miRNA及其目标基因的表达水平。结果表明,解袋后mdm-miR828和mdm-miR858及其目标基因MdbHLH和MdMYB9在调控两个品种果皮花青苷合成中均起到促进花青苷积累的作用;mdm-miR156及其目标基因MdSPL仅能促进‘澳洲青苹’解袋后果皮中花青苷的积累,与‘新红星’花青苷合成调控无关;miR5072及其目标基因MdANR对解袋后的‘新红星’果皮花青苷合成有促进作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S661.1

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本文编号：2470711