苹果属观赏海棠类黄酮种类、代谢及生物活性分析

发布时间：2019-07-01 19:49

【摘要】：观赏海棠属于苹果属植物家族中的一员,由于其叶色色彩丰富,花色有红白粉,且花期时间较长,果实小且色彩明亮,宿存期长,所以观赏海棠在我国作为一种观赏性植物广泛的种植。但是除了具有较高的观赏价值之外,其植物体内富含多种的天然生物活性物质,这些生物活性物质的开发和提取对医药、日化、食品等领域的发展具有重要意义,也是我国农业研究的一个重点方向,越来越受到人们的重视。其中二氢查尔酮类化合物在自然界中存在很少,作为‘少数黄酮类’化合物具有潜在的研究价值;其中已有研究报道二氢查尔酮根皮苷在苹果植物中含量丰富,由于其甜味高,热量低的优良特性,同时还具有美白的功效,其作为一种食品甜味剂和美白成分用于添加到食品和化妆品的制造业中。观赏海棠作为苹果属植物中的野生资源,其类黄酮的类型和含量更为丰富,比栽培种苹果植物更具有较大的研究与开发利用价值,但有关此类植物中类黄酮物质的研究报道较少,尤其是二氢查尔酮类化合物的研究,开发以及利用基本处于空白;因此,全面的研究类黄酮物质在植物体内的种类与分布,探究类黄酮物质的生活活性,通过筛选,重点选育出二氢查尔酮类化合物含量高的植物品种,利用分子生物学方法,研究二氢查尔酮类化合物代谢合成途径中的关键基因和转录因子,最后利用基因工程、代谢工程技术合成二氢查尔酮类物质,是进行产业化生成的必由之路,具有积极的学术价值和可以预见的经济和社会价值。本研究以新叶有色类典型品种‘绚丽’为主要试验材料,以常色紫红叶类典型品种‘王族’和绿叶类典型品种‘火焰’为对比材料,首先通过高效液相色谱质谱联用(HPLC-MS)以及超高液相色谱质谱联用(UPLC-QTOF-MS)技术检测了根,叶,花瓣,果皮和果肉中类黄酮物质的类型,采用高效液相色谱法(HPLC)分析了叶片,花瓣和果实中每一个类黄酮物质在不同发育时期中的含量变化,重点分析了二氢查尔酮化合物的种类以及分布部位;其次,通过多种统计学分析手段,主要包括多样性分析,主成分分析以及聚类分析等分析方法优选出具有最佳时空格局的发育时期,同时筛选出优势植物材料;第三,通过体内动物模型和体外试验,结果表明在观赏海棠类黄酮系统中不同化合物之间通过协同互作的方式,产生了协同抗氧化的功能;第四,本研究系统分离纯化出观赏海棠中的主要类黄酮组分,并通过核磁共振技术验证出两种新的二氢查尔酮化合物;第五,本研究分离纯化出来的二氢查尔酮单体,通过mtt法[mtt,四氮唑,3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide],验证了它们的抗肿瘤活性;最后,通过分子生物学手段,探讨调控二氢查尔酮类化合物代谢途径中的关键myb转录因子与主要结构基因。本研究中的主要试验结果如下:1.通过hplc-msn和uplc-qtof-msn技术检测,观赏海棠中含有类黄酮类型最多的是叶片,‘王族’有17种,‘绚丽’有21种,‘火焰’有15种;其次是花,‘王族’有17种,‘绚丽’有17种,‘火焰’有17种;再次是果皮和果肉,‘王族’果皮有15种,果肉有9种,‘绚丽’果皮有15种,果肉有10种;‘火焰’果皮有11种,果肉有9种,根的最少,三个品种均为2种。这些主要的类黄酮化合物包括花色苷,黄酮醇,二氢查尔酮、黄烷醇和二氢黄酮醇,其中在观赏海棠中,二氢查尔酮类化合物主要有13种,且绚丽品种中的二氢查尔酮化合物类型丰富;通过hplc方法,类黄酮物质含量最丰富的部位是叶片,其次是花瓣,果皮和果肉;二氢查尔酮根皮苷含量最多的部位是根;果肉中类黄酮物质的含量最少;此外,通过多样性分析,主成分分析以及聚类分析,本研究建立一种分析手段,此方法也可以运用到对其它植物中复杂的类黄酮系统的分析研究中。2.通过体内动物模型和体外两种试验结果表明,观赏海棠红色叶片‘王族’具有很强的抗氧化能力,这种植物资源可以作为一种新的食品添加剂加以开发利用;通过改进hplc-abts在线测定抗氧化系统,从总的抗氧化能力大于单个化合物的抗氧化总和,研究表明在植物体内的类黄酮系统中存在一种协同抗氧化功能;通过分析动物模型中总抗氧化能力与血糖、胆固醇和甘油三酯的线性回归方程,表明摄取一定的抗氧化剂,动物体内可以增强抵抗力,防御疾病保护身体机能。3.利用分离纯化系统以及核磁共振技术,本研究系统分离了海棠叶片中的类黄酮化合物,共得到了20个化合物。其中黄酮醇类化合物8个:hty-1(胡桃宁,418.35),hty-2(扁蓄苷),hty-3(槲皮素-3-o-葡萄糖苷),hty-5(槲皮素-3-o-鼠李糖苷),hty-8(槲皮素-3-o-木糖苷),hty-9(槲皮素-4’-o-葡萄糖苷),hty-10(芦丁),hty-30-1(槲皮素)。二氢黄酮醇类化合物2个:hty-14(落新妇苷),htyzb-4(花旗松素-3-o-葡萄糖苷)。二氢查耳酮类化合物7个:hty-4(三叶苷),hty-12(根皮苷),hty-30-2(根皮素),hty-30-5(3-羟基根皮素),htyzb-1-3(6′′-o-香豆酰基-4′-o-葡萄糖基-根皮素,海棠苷a),htyzb-1-4(3′′′-甲氧基-6′′-o-阿魏酰基-4′-o-葡萄糖基-根皮素,海棠苷b),htgl-4(根皮素芸香糖苷)。黄烷醇类化合物1个:hty-11(表儿茶素)。酚酸类化合物1个:hty-15(隐绿原酸)。二氢黄酮类化合物1个:hty-30-3(圣草酚)。其中htyzb-1-3(6′′-o-香豆酰基-4′-o-葡萄糖基-根皮素,海棠苷a),htyzb-1-4(3′′′-甲氧基-6′′-o-咖啡酰基-4′-o-葡萄糖基-根皮素,海棠苷b)为首次发现的新化合物。4.通过测定人体癌细胞试验,本研究提取分离纯化出来的7个二氢查尔酮单体化合物表现出显著的生物活性。尤其单体化合物根皮素(A2),3-羟基根皮素(A3),6′′-O-香豆酰基-4′-O-葡萄糖基-根皮素,海棠苷A(A6)和甲氧基-6′′-O-阿魏酰基-4′-O-葡萄糖基-根皮素,海棠苷B(A7)对肿瘤细胞系A549,Bel 7402,HepG2和HT-29有着较强的抑制活性,其中海棠苷B化学结构式中含有一个甲氧基基团,活性更为明显。这表明二氢查尔酮这类化合物可能对人体健康有着重要的影响,可以考虑作为一种潜在的治疗癌症的药物发展利用。同时,结果表明,观赏海棠是一种天然的具有显著抗肿瘤效果的可利用自然资源,此外,本研究分离出的两个新稀有化合物A6和A7可发展成一种新型的具有研究价值的抗肿瘤活性药物。5.利用VIGS以及实时荧光定量PCR技术进行MYB10沉默试验,二氢查尔酮化合物的含量以及相关基因表达量下降,说明MYB10转录因子可以调控观赏海棠叶片和果皮中二氢查尔酮的合成;沉默MYB16转录因子对二氢查尔酮化合物有上调的作用;乙酰化通过下调ENRL基因来调控NADPH的合成,进而抑制二氢查尔酮根皮苷的合成,去乙酰化通过上调NADPH促进二氢查尔酮根皮苷的合成;本研究结果表明,观赏海棠中调控二氢查尔酮根皮苷合成代谢途径中的关键酶是NADPH,McCHS在一定程度上可以促进根皮苷的合成,但不是起着决定作用;McENRL基因的上调对根皮苷的合成起着直接作用。综合以上研究结果,观赏海棠中含有大量的抗氧化物质,其中二氢查尔酮化合物是一类具有抗肿瘤活性的重要的天然化学产物,尤其是首次分离纯化出来的新二氢查尔酮化合物海棠苷A和海棠苷B,可以作为一种新的抗癌药物开发利用;同时,揭示出了调控植物体内二氢查尔酮类化合物的关键基因和转录因子。本研究对观赏海棠中类黄酮物质,特别是二氢查尔酮类化合物的开发与利用提供了重要的理论基础和技术支撑。
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【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S685.99

【参考文献】