应用表达谱芯片技术和microRNA测序筛选奶牛金黄色葡萄球菌人工诱导乳腺炎关键基因的研究

发布时间：2019-07-13 21:26

【摘要】：奶牛乳腺炎是奶牛养殖业中流行最广,造成经济损失最大的一种奶牛疾病,国内外对奶牛乳腺炎的研究已经有百余年历史,但是至今仍未彻底解决这一难题。金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎的主要致病菌之一,通过研究奶牛乳腺感染金黄色葡萄球菌后引起乳腺炎发生过程中miRNAs和基因的特异性表达,可以有目的地调节炎症发生中某些蛋白的表达,有利于发展出一套新的奶牛乳腺炎预防、治疗方法。本研究利用金黄色葡萄球菌人工感染中国荷斯坦奶牛乳腺,构建金黄色葡萄球菌人工感染奶牛乳腺炎疾病模型；再分别采集金黄色葡萄球菌诱发乳腺炎和正常健康乳腺组织提取总RNA,分离、构建文库。利用Affymetrix牛基因组表达谱芯片技术分析金黄色葡萄球菌人工感染奶牛乳腺组织引起乳腺炎后全基因组范围内的基因差异表达,并利用Q-PCR技术对基因芯片的结果进行验证,对差异表达基因进行GO和Pathway分析。同时利用Solexa高通量测序技术分析健康乳腺和乳腺炎乳腺的miRNA表达差异；利用Q-PCR技术对测序结果及其靶基因进行验证。采用生物信息学分析软件预测这些miRNA可能的靶基因,并对靶基因进行GO分析和KEGG分析。主要研究结果如下：(1)本研究成功构建金黄色葡萄球菌人工感染奶牛乳腺炎疾病模型,感染后的奶牛表现明显的临床型乳腺炎症状。(2)基因表达谱芯片共筛选出显著差异基因297个,188个基因表达上调,109个基因表达下调(FC2,P0.05)。再采用Q-PCR随机选择8个显著差异表达的基因(C3、 TLR8、BoLA-DRB3、PTX3、CSF3、SLC11A1、CD80、IL17A),对其进行表达定量分析,获得与基因芯片分析一致的结果。对差异表达基因进行GO分析,共注释到151个GOTerms (GO注释)(P0.05)。对差异表达基因进行KEGG分析,结果显著富集到15条Pathway,主要有：自然杀伤细胞介导的细胞毒作用信号通路、造血细胞谱系信号通路、细胞因子信号通路、趋化因子信号通路等。(3)利用Solexa高通量测序技术分别对金黄色葡萄球菌感染组乳腺组织(金葡组)和健康组乳腺组织(健康组)进行测序分析,金葡组和健康组分别获得21,293,853条和19,142,094条原始序列,过滤低质量、重复等序列后获得20,847,000条、9,535,613条纯净序列。通过和相应mirbase数据库比对分析,金葡组鉴定有358个已知miRNA和232个候选miRNA,健康组鉴定有373个已知miRNA和399个候选miRNA。比对分析表明,金葡组和健康组相比,共有77条miRNA表达差异显著(P0.01,log21)。选择其中10个差异显著表达的miRNA(bta-miR-223、bta-miR-31、bta-miR-205、bta-miR-145、bta-miR-132、 bta-miR-130、bta-miR-200b、bta-miR-1246、bta-miR-196a、bta-miR-184)进行Q-PCR验证,验证结果和测序结果一致。对这些差异miRNA进行靶基因预测,共预测到19792个靶基因。GO分析表明这些靶基因参与调控细胞的结合、催化活性、免疫等过程,KEGG分析显示其主要富集于环境微生物代谢信号通路、内吞作用信号通路、嗅觉转换信号通路、癌症信号通路等。(4)将miRNA测序和mRNA表达谱结果进行关联分析,结果显示共得到233对负关联的miRNA/mRNA,其中miRNA下调,mRNA上调的为162对；miRNA上调,mRNA下调的为71对。上述选择的10个差异显著的miRNA关联到47个靶基因,通过Q-PCR技术对其中8个差异显著基因(ST3GAL3、IL13RA2、ARID3A、ADAP1、SYNE2、 SLCO4A1、GRAMD1C、SLC5A1)进行荧光定量检测,结果显示：ST3GAL3、IL13RA2、 ARID3A、ADAP1、SLCO4A1基因在金葡组表达显著高于健康组,而SYNE2、GRAMD1C、 SLC5A1基因在金葡组表达均低于健康组,基因表达情况与芯片的结果一致,上述结果表明这些差异基因可能是金黄色葡萄球菌诱导奶牛乳腺炎发生发展的关键基因。
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图片说明： 巧支持物表面上的探针进行杂交，，通过放射自显影或癸光共聚焦显微镜扫描，对这些杂交逡逑图谱进行检测，再利用计算机对每一个探针上的杂交信号作分析处理，便可得到目的材料逡逑中有关基因表达信息（图１－２）。该技术可将大量的探针同时固定于支持物上，所＾可（＾＞１逡逑一次性对大量核酸分子进行检测分析。逡逑＾邋Ｐｕｒｉｆｙ逦古邋Ｐｕｒｉｆｙ逦＾邋Ｐｕｒｉｆｙ逦＾邋Ｐｕｒｉｆｙ逡逑ｍ巧ＮＡ逦ｍＲＮＡ逦ｍＲＮＡ逦ｍＲＮＡ逡逑＾邋Ｌａｂｅ！逦＾邋Ｌａｂｅｌ逦＾邋Ｌａｂｅｌ逦＾邋Ｌａｂｅｌ逡逑ｃＤＮＡ逦ｃＤＮＡ逦ｃＤＮＡ逦ｃＤＮＡ逡逑ｉ邋Ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ，逦Ｉ逦Ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ，逡逑ｗａ洗逦Ｉ逦ｗａｓｈ逦？逡逑ａｎｄ邋ｓｃａｎ逦｜逦ａｎｄ邋ｓｃａｎ逡逑一＾邋Ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ邋ａｎｄ邋ｗａｓｈ逡逑了Ｓ叩ｅｒｉｍｐｏ拍逦｜邋Ｓｃａｎ邋ａｎｄ邋ｓ叩ｅｒｉｍｐｏｓｅ逡逑Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋ＬＪＩ逦Ｉｏｏｏｏｏ逡逑ｒ＿＿ＩＭ逦ｏｏｏｏt板义希�Ｐ——Ｖｗｗｄ逦，�彟彟邋Ｖｐｗｓｓｄ逡逑Ａｃｔｉｖａｔｅｄ逦ｇｅｎｅ逦Ａｃｔｉｖａ化ｄ邋■一。一。一■邋ｇｅｎｅ逡逑ｇｅｎｅ逦Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ邋ｉｍａｇｅ逦ｇｅｎｅ邋Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ邋Ｉｍａｇｅ逡逑Ｏｎｅ－ｃｏｌｏｒ邋ｅｘｐｒｅ姐ｏｎ邋ａｎａｌｙｓｉｓ逦Ｔｗｏ－ｃｏｌｏｒ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ａｎａｌｙｓｉｓ逡逑图１－２基因巧片工作原理逡逑Ｆｉｅ．邋１－２邋Ｗｏｒｋｉｎｅ邋ｏｒｉｎｃｉｒｄｅ逡逑基因忘片数据处理、分析的流程为：①芯片的扫描与图像的识别
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图片说明： 分别取金葡组孰腺组织和健康组现腺组织制成组织切片，通过ＨＥ染色对奶牛乳腺组逡逑织进行病理学检查，发现健康组乳腺组织腺泡腔完整，腺泡腔之间组织厚实且完整，郭导逡逑管正常（图２－１Ａ）；金葡组乳腺组织腺泡腔内有大量炎性粒细胞的堆积，腺泡腔壁变薄甚逡逑至断裂，严重变形，有空腔出现，乳腺间质出现水肿，判断为典型的奶牛临床型乳腺炎病逡逑理反应（图２－１Ｂ）。逡逑WW逡逑图２－１乳腺组织ＨＥ染色（４０0ｘ）逡逑Ｆｉｇ．２－１邋ＨＥ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ｍａｍｍａｒｙ邋ｇｌａｎｄｓ邋ｔｉｓｓｕｅ．邋（４０0ｘ）逡逑Ａ：健康组；Ｂ：金菊组逡逑（Ａ）邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ；邋（Ｂ）义幻ｗ化ｇｒｏｕｐ逡逑２．２邋ＲＮＡ提取及质量检测逡逑分别取健康组孰腺姐织和金葡姐乳腺组织提取总ＲＮＡ，然后对提取的总ＲＮＡ进行琼逡逑脂糖凝胶电泳检测，电泳带型清晰无杂带和拖尾，表明ＲＮＡ无降解，（图２－２）。总ＲＮＡ逡逑ＯＤ２６０ｎｍ：邋ＯＤ２８０ｎｍ比值均在２．０左右（表２－３）。总ＲＮＡ完整性及质量良好，可Ｗ用逡逑于后续试验。逡逑
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.23

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本文编号：2514298