小麦和水稻对异丙隆和阿特拉津的毒性反应及代谢降解机制的研究

发布时间：2019-07-18 10:43

【摘要】：小麦和水稻作为我国种植面积最广的两种主要粮食作物,其安全生产关乎国家命脉,而农药残留已成为食品和环境安全两大热门问题的焦点之一。因此,研究既能提高作物自身解毒能力又能促进种植土中农药降解的方法,使作物不受农药毒害的同时改善种植土壤环境,是保证农作物安全生产、保护农田生态环境的一个重要科学问题。异丙隆和阿特拉津是两种常用的除草剂,然而大量研究发现环境中残留的异丙隆和阿特拉津对土壤微生物和动植物产生严重影响,甚至通过食物链威胁人类健康。目前,欧盟水框架指令已经把异丙隆和阿特拉津列为潜在致癌物并已禁用,但许多发展中国家(包括中国)仍在使用。本论文研究了水稻对异丙隆的毒性反应。结合化学分析检测和高通量测序(RNA-Seq)方法研究了异丙隆在水稻中代谢降解和分子调控解毒机制。针对农药异丙隆的代谢可能受到植物激素的调控作用,探究了水杨酸对小麦代谢异丙隆的影响,并对有关机理进行阐释。同时发现水杨酸对种植土壤中异丙隆的加速降解作用,研究了水杨酸对根系分泌物及土壤微生物的影响。针对农药胁迫下作物表观遗传的变化以及调控基因表达机制,初步探讨了阿特拉津胁迫下水稻DNA甲基化变化的情况,并分析了 DNA甲基化调控农药胁迫诱导基因表达及降解代谢的机理。具体内容以下:1.为了研究农药残留对作物的毒性伤害,本文选用不同浓度的异丙隆(0,2,4, 6和8 mg L-1)处理水稻幼苗,结果发现异丙隆处理提高了水稻幼苗组织中丙二醛含量,且在2mgL-1异丙隆处理浓度下达到最高值。同时,异丙隆抑制了水稻幼苗的根叶生长和其叶绿素含量,造成了水稻幼苗组织的氧化损伤,影响了水稻的正常生长。当异丙隆处理浓度为2 mg L-1时,激活了水稻幼苗体内抗氧化酶系超氧化物歧化酶(SOD)、漆酶(Laccase)、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)的活力,用于抵抗农药异丙隆带来的氧化胁迫。2.为了研究作物应答农药异丙隆胁迫的分子机理与其代谢机制,本文选择了已知全基因组序列的优秀模式植物水稻作为研究对象,采用高通量测序技术对水稻幼苗转录组进行大规模测序,并构建了水稻茎叶和根系异丙隆处理和非处理的四个表达文库。结果显示,四个表达文库Clean tags测序量达到10,879,252～14,519,285个。通过与水稻参考基因组的比对分析,四个库中比对上已注释的基因数为31,009～32,118个。其中,在水稻幼苗根系和茎叶中对异丙隆胁迫响应的差异表达基因分别有11,680和11,927个。进一步对差异表达基因进行Gene Ontology (GO)功能注释和Kyoto Encylopeida of Genes and Genomes (KEGG)分析发现多数差异表达基因与“对环境压力的抗性”、“外源物的降解和代谢”等一些代谢通路和生物过程有关。从转录组测序数据中随机选取12个差异表达基因做荧光定量PCR验证,验证结果与测序结果一致,说明了测序结果的可靠性。进一步筛选出与响应异丙隆胁迫的代谢解毒相关基因并测定了几个重要解毒酶活力,包括:糖基转移酶(GTs)、细胞色素P450(P450)、谷胱甘-S-硫转移酶(GST)以及甲基转移酶(MTs)。进一步对这些基因进行启动子及转录因子结合位点预测分析,意外发现其中大多数的启动子区都含有对植物激素响应的元件,并通过共表达分析找到了5个调控降解代谢基因的转录因子。运用超高效液相色谱串联离子阱质谱(UPLC/Q-LTQ-MS2)分析鉴定了 19个水稻植株体内异丙隆代谢产物,其中有11个代谢物是第一次在植物中被发现和报道的。根据代谢物的结构推测了异丙隆在水稻体内可能的代谢途径及参与的代谢酶,并结合转录组测序结果发现许多参与的代谢酶基因在异丙隆胁迫都发生了差异表达。3.为了验证农药代谢受到植物激素的调控作用,本文探究了植物激素水杨酸对作物降解代谢农药异丙隆的影响。以异丙隆和小麦为供试农药及农作物,水杨酸为外源叶面喷施植物激素,通过测定电导率和植物表型研究了水杨酸处理下异丙隆对小麦胁迫的影响。结果发现5 mg L-1水杨酸处理缓解了异丙隆对小麦的毒害。通过超高效液相色谱串联飞行质谱(UPLC/Q-TOF-MS2)分析鉴定了 15个小麦植株体内异丙隆代谢产物,其中有4个代谢物区别于水稻代谢物并在植物中被第一次发现和报道。根据代谢物的结构推测了异丙隆在小麦体内可能的代谢途径并发现绝大多数Ⅱ相代谢物(即:结合物)为糖基化产物。对代谢物进行相对定量分析后发现,与对照组相比水杨酸处理的小麦体内异丙隆积累量明显降低,而部分代谢产物丰度显著增加,特别是糖基化产物。结果表明水杨酸加速了异丙隆在小麦体内的代谢速率,特别是Ⅱ相糖基化代谢速率。外施水杨酸下异丙隆处理小麦体内的糖基转移酶活力显著增高。同时,选择了 4个已有文献报道的小麦糖基转移酶基因,并测定其在水杨酸和异丙隆处理下的表达量变化。结果发现4个糖基转移酶基因的表达量都受到异丙隆处理的诱导。其中一条编码水杨酸糖基转移酶的基因(基因号:CD876318)在水杨酸作用下出现高表达。可见,外源使用水杨酸刺激了水杨酸糖基转移酶基因的表达,增加了异丙隆降解产物以及糖基化产物的丰度,加速了农药在小麦体内的降解,从而缓解了异丙隆对小麦的毒害作用。4.为了探索同时发现的水杨酸对小麦种植土壤中异丙隆有加速降解作用的原因,本文对土壤中两个主要影响农药降解的因素(植物根系分泌低分子有机酸和土壤微生物)展开研究。结果发现水杨酸的应用显著提高了根际土壤中酒石酸、苹果酸和草酸3种低分子有机酸的含量。研究了外源水杨酸对小麦种植土中微生物种群数量与群落结构的影响,测定了根际、混合和非根际土中土壤微生物有机碳、氮(SMBC/N)和磷脂脂肪酸(PLFAs)的含量。结果显示,水杨酸处理下的小麦种植土中土壤微生物有机碳氮含量与对照组相比明显升高,在根际土中尤为显著。用于表征微生物总量的总磷脂脂肪酸(PLFAs)含量也受到水杨酸影响而显著上升;一些表征土壤压力的特征磷脂脂肪酸含量显著下降,以及部分表征细菌(如:革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌)和真菌的特征磷脂脂肪酸含量显著上升。结果说明,水杨酸诱导植物分泌的低分子有机酸,丰富了土壤中微生物的数量和种群结构,缓解了异丙隆对土壤生态的胁迫。本文还测定了过氧化氢酶(CAT)、脱氢酶(DHA)和酚类氧化酶(PO) 3种土壤降解酶活力。结果表明,异丙隆显著抑制了脱氢酶和酚类氧化酶的活力,而水杨酸处理明显缓解了这种抑制。通过主成分分析和相关矩阵分析得出水杨酸的应用与土壤低分子有机酸、土壤酶、土壤微生物数量和异丙隆降解速率成正相关。通过UPLC-TOF-MS2分析鉴定了 5个异丙隆在种植土中的代谢产物。与对照组相比,施用水杨酸后小麦体内有更多异丙隆降解产物被检出。水杨酸作为一个信号转递分子,诱导了小麦根系分泌低分子有机酸。同时,低分子有机酸作为营养源,促使根系周围微生物的大量繁殖,加强了“根际效应”,从而提高了根系周围农药异丙隆的降解速率。5.为了解决农药胁迫下表观遗传的变化与基因表达的调控机制尚不明确的问题,本文利用全基因组甲基化测序手段,展示了阿特拉津处理下的水稻全基因组DNA甲基化单碱基分辨率谱图。结果显示阿特拉津处理改变了水稻基因组中许多CG和非CG的甲基化位点和水平。结合转录组测序结果分析发现,阿特拉津改变了许多编码DNA甲基转移酶、组蛋白甲基转移和DNA去甲基转移酶的基因的表达。在阿特拉津处理的水稻中,本文发现了基因在其上游、本体和下游区域发生高甲基化情况多于低甲基化。DNA甲基化和表达谱数据的关联分析发现,与对照相比有674个基因在阿特拉津胁迫下甲基化水平发生改变,其转录水平也存在显著差异。从中选择出一些参与外源物代谢的基因,测定其在甲基化或去甲基化功能缺失突变体中的表达量变化。结果表明,DNA甲基化影响了基因的转录水平,特别是小RNA介导的DNA甲基化。另外,本文用DNA甲基化通用抑制剂5-azacytidine(AZA)和阿特拉津共同处理水稻幼苗,发现在阿特拉津胁迫下,AZA处理促进了水稻的生长并减少了阿特拉津在其体内的积累量。运用UPLC/Q-TOF-MS2在水稻体内鉴定了 8种阿特拉津降解产物和9种结合物。其中,有2个阿特拉津代谢产物在水稻中是第一次被报道。对代谢产物进行定量分析的结果显示AZA处理提高了一部分代谢产物的相对丰度,包括:P450介导的降解产物DIA和HA,以及大多数GST介导的谷胱甘肽缀合物。综上所述,阿特拉津通过诱导水稻基因组甲基化的改变,调控了参与代谢和解毒的一些基因的表达,从而达到降解阿特拉津的目的。
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图片说明： 低（以ｍｇ邋ｋｇ“鲜重计量），通常以游离态和结合态两种形式存在，其结合态包括：糖逡逑基化、甲基化或氨基酸结合物等（Ｌｅｅ等，１９９５）。植物体中水杨酸的合成主要通过两逡逑条途径，分别是异分支酸合成酶途径和苯丙氨酸解氨酶合成途径（图１－３）。逡逑Ｓｈｉｋｉｍｉｃ邋ａｃｉｄ邋ｐａｔｈｗａｙ逡逑Ｈ逡逑Ｈ00ｃ邋－邋｜邋＿ＣＨＳ邋＾，，ＣＯＯＨ逦９°°＂逦ｆ°Ｈ逡逑Ａｒｏｇｅｎｉｃ邋ａｃｉｄ逦０邋ＣＯＯＨ逡逑0Ｈ逦ｃＬ邋—丨？逡逑ＣＯＯＨ逦ＣＯＯＨ逦ＣＯＯＨ逦｝逡逑［Ｊ邋逦＾邋Ｌ逦１逦Ｂｅｎｚｏｙｌ邋ｇｌｕｃｏｓｅ逡逑Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ邋Ｃｉｎｎａｍｉｃ邋ａｃｉｄ逦ＣＯＯＨ逦／邋Ｓａｌｉｃｙｄｉｃ邋ａｃｉｄ逡逑ｉ逦ｖ邋ｙ逡逑Ｔ逦N，逡逑ＣＯＯＨ逡逑＾逦ｕ逡逑Ｏ＇Ｃｏｕｍａｒｌｃ邋ａｃｉｄ逡逑ＬＪ邋＾Ｕｇｎｉｎ逡逑Ｒａｖｏｎｏｌｄｓ逡逑ＯＨ逡逑ｐ－Ｃｏｕｍａｒｉｃ邋ａｃｉｄ逡逑图１－３水杨酸的生物合成途径（ＭＳｔｒａｕｘ，邋２００２）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－３邋Ｔｈｅ邋ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ邋ｐａｔｈｗａｙｓ邋ｆｏｒ邋ｓａｌｉｃｙｌｉｃ邋ａｃｉｄ邋ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．逡逑１３逡逑
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图片说明： ２００３）和根系的向地性（Ｍｅｄｖｅｄｅｖ和Ｍａｒｋｏｖａ，１９９１）以及抑制了果实成熟逡逑（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ和Ｄｗｉｖｅｄｉ，２０００）。除了游离的水杨酸外，植物体内还存在许多结合态的水逡逑杨酸，如：甲基水杨酸（图１－４）。近年来，研究发现甲基水杨酸是一个长距离信号分逡逑子，可以由感染病毒的叶片快速转移到未感染的叶片，甚至可以达到植物根部（Ｎｉｅｄｅｒｌ逡逑等，１９９８）。最新研究发现，烟草中的甲基水杨酸是一个调控植物系统获得抗性的远距逡逑离关键信号分子（Ｐａｒｋ等，２００９）。逡逑Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ逦｜邋Ｓｈｉｋｉｍｉｏ邋ａｃｉｄ邋Ｐａｔｈｗａｙ逡逑Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ逦氐逦Ｔ逡逑Ｏｆ邋ＳＡ邋Ｊ逦Ｃｈｏｒｉｓｍａｔｅ邋￣￣？邋－－？邋Ｐｈｅ逡逑｜逦Ｉｓｏ－ｃｉｒｉｓｍａｔｅ邋Ｔｒａ＾ｉｍｉａ＾ｉｄ逡逑＇ｆ逦Ｂｅｎｚｏｉｃ邋ａｃｉｄ逦ｏ－ｃｏｕｍａｒｉｃ邋ａｃｉｄ逡逑｜逦Ｉ逡逑ｎ逦ＳＡ逦ＳＡ逦ＳＡ逡逑．逦１逦Ｊ逦１逦
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S481


本文编号：2515836