印楝素作用靶标蛋白的筛选和验证

发布时间：2019-08-24 07:59

【摘要】：印楝素作为优秀的植物源农药之一,具有广谱的杀虫活性,以及低毒、低抗性、低残留的特点,有广泛的应用前景和开发潜力。印楝素的杀虫机制主要表现为拒食作用和调节生长发育,但到目前为止印楝素的作用靶标蛋白尚不明确。为了寻找和验证印楝素的靶标蛋白,从分子水平揭示印楝素的作用机制,本文以哺乳动物细胞系为研究对象,以昆虫细胞系作为参照体系,通过检测印楝素对细胞生长增殖的影响,检测生长因子受体激动剂和PI3K抑制剂与印楝素协同作用,研究印楝素与生长因子受体和PI3K的关系,筛选PI3K/Akt信号通路上可能的作用靶标。通过基因工程技术重组筛选到的可能作用靶标蛋白,利用荧光光谱淬灭法和等离子共振法体外研究印楝素与目标蛋白的结合,分析印楝素的作用模式。在此基础上,解析印楝素抑制细胞生长和增殖的作用机制。主要结果如下:1.根据细胞生长速度和印楝素的抑制程度,从11种细胞系中筛选出人口腔上皮癌KB细胞株,小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3,人小细胞肺癌细胞H1299 3种哺乳动物细胞系和斜纹夜蛾卵巢细胞系SL-1。检测不同浓度印楝素对细胞生长和增殖的影响,3μg/mL、12μg/mL、48μg/mL、192μg/m L工作浓度,在4种细胞系中具有明显的细胞毒性和抑制生长增殖的活性,抑制率与印楝素浓度成正比。根据试验结果,为后续的试验选取了低浓度组3μg/mL、12μg/mL作为后续试验工作浓度。采用罗丹明123染料处理细胞检测印楝素处理细胞后线粒体膜电位的变化。试验结果表明,在印楝素的工作浓度处理组,与正常细胞对照组相比,检测到膜电位的降低,证明印楝素处理的4种细胞作用机制涉及线粒体途径。2.利用反向对接分析信号通路PI3K/Akt信号通路上的重要蛋白与印楝素结合能力,根据打分和结合位点综合评估,初步确定生长因子及其受体和PI3K为可能的靶标。外源添加生长因子受体激动剂FGF-2和EGF和PI3K抑制剂Wortmannin,通过细胞生长和增殖变化,研究印楝素与生长因子受体、PI3K的关系。试验结果表明,生长因子受体激动剂FGF-2促进细胞生长增殖,印楝素显著的抑制外源FGF-2的促细胞生长和增殖。在外源生长因子最大促生长浓度18.75ng/mL,印楝素工作浓度2μg/m L和3μg/m L,可抑制90%的促增殖作用。3.基因工程重组FGFR-2胞外段。采用荧光淬灭试验和SPR两种不同的方法在体外检测印楝素与FGF-2和FGFR-2,分别证明了印楝素与FGFR2相互作用,以及印楝素抑制FGF-2和FGFR2的结合。SPR试验结果表明,经印楝素与分别与FGF2和FGFR2孵育后结合均有不同程度的下降,与印楝素浓度相关。印楝素与FGF-2孵育进样,在130nM浓度下,和260nM浓度下,印楝素处理组结合分别下降7%和35%。在FGFR2与印楝素分别以1:1,1:1.5,1:2,的浓度比孵育时,测定的结合抑制率分别为14.04%,14.6%,57.9%。4.利用分子模拟技术,以FGF2-FGFR2晶体结构为模板通过分子对接软件,建立印楝素与FGFR2的结合复合物模型。研究结果表明印楝素在哺乳动物细胞中,通过抑制FGF-2和FGFR2之间的结合来调控细胞的生长和增殖。印楝素通过抑制膜上受体信号启动,而对下游信号产生影响,致使细胞生理活动的异常,最终表现出生长和增殖的抑制和诱导凋亡。
【图文】：

印楝素作用靶标蛋白的筛选和验证

印楝素化学结构

印楝素作用靶标蛋白的筛选和验证

印楝素对幼虫中肠、成虫盘、脑以及营养代谢物、胰岛素受体InR的影响
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S482.39

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