生防菌淡紫拟青霉的基因组及其抗生素leucinostatins生物合成途径的研究

发布时间：2019-09-23 14:26

【摘要】：植物寄生线虫寄主广泛,每年在农业生产中造成巨大的经济损失。由于化学防治对环境污染严重并且威胁人畜的健康,生物防治越来越受到人们的关注。淡紫拟青霉是农业上一种非常重要的生防真菌,对植物寄生线虫具有很好的生防作用。此外,淡紫拟青霉对枯萎病、棉花蚜虫和切叶蚁等多种病虫害具有很好的防治作用。淡紫拟青霉能够寄生于线虫卵,在侵染的过程中,几丁质酶和丝氨酸蛋白酶等多种水解酶类和蛋白酶类发挥重要作用。次级代谢产物也在防控病虫害过程中起了不可或缺的作用。Leucinostatins是从淡紫拟青霉发酵液中分离到的一种脂肽类抗生素,具有抗肿瘤细胞、抗细菌、抗真菌、抗锥形虫等生物活性。对于leucinostatins分子生物学方面的研究,包括合成基因以及合成途径,目前还没有报道。本研究的目的是通过对两个淡紫拟青霉菌株(PLBJ-1和PLFJ-1)进行基因组测序,揭示淡紫拟青霉的基因组特征,鉴定leucinostatins合成酶基因簇,解析leucinostatins的合成途径。为了开展淡紫拟青霉基因功能的研究,开发了该菌的PEG介导的原生质体遗传转化体系。对淡紫拟青霉菌株PLBJ-1进行了GFP转化。紫外光激发下,转化菌株在荧光显微镜下发出绿色荧光,并且单孢继代培养六代后,荧光能够稳定遗传。基因组数据表明,PLBJ-1和PLFJ-1的基因组大小分别为38.14 Mb和38.53 Mb,分别含有144和163个scaffold,两个菌株的重复序列含量分别为6.07%和6.00%,分别预测出11773和11763个蛋白编码基因。PLBJ-1与PLFJ-1的共线性分析表明两个菌株具有很好的共线性关系。对淡紫拟青霉的主要蛋白家族进行预测,发现两个菌株均具有较多的水解酶类、蛋白酶类和致病相关蛋白等家族的合成基因。用单拷贝同源蛋白构建的系统发育分析表明,与淡紫拟青霉关系最近的是Tolypocladium inflatum和Tolypocladium ophioglossoides,三个线虫寄生菌(淡紫拟青霉、Hirsutella minnesotensis和Pochonia chlamydosporium)分别与昆虫寄生菌(T.inflatum、Ophiocordyceps sinensis和Metarhizium anisopliae)聚到同一分支上,说明线虫寄生菌与昆虫寄生菌很可能具有共同的祖先。淡紫拟青霉的基因组中共编码13个PKS、10个NRPS、两个PKS-like、10个NRPS-like、1个DMATS、4个TS和1个PKS-NRPS杂合体,表明淡紫拟青霉具有很大的天然产物开发的潜力。基于leucinostatins的结构以及淡紫拟青霉中次级代谢产物合成基因的预测,确定了VFPBJ_02539为leucinostatins合成酶的候选基因。对lcsA基因进行同源敲除,得到VFPBJ_02539基因功能缺失的转化子ΔlcsA。对PLBJ-1的野生型菌株与突变体ΔlcsA发酵液的粗提物进行HPLC比较分析,发现与野生型菌株的粗提物相比,ΔlcsA的粗提物少了两种物质。对这两个峰进行质谱鉴定,同时与leucinostatin A和B的标准品比对分析,结果表明ΔlcsA缺失的两个物质为leucinostatin A和B,证明了NRPS合成酶基因lcsA负责leucinostatins的生物合成。比较在两种培养基(诱导leucinostatins产生的Lab-made-PDB和非诱导leucinostatins产生的PDB-BD)中与lcsA相关的基因表达情况,发现lcsG到lcs T共20个基因处于共表达的状态。转录组数据以及野生型和ΔlcsA中q RT-PCR的分析结果均表明:共20个基因(lcsA-lcsT)参与了leucinostatins的生物合成,基因簇中包括1个NRPS合成酶和两个PKS合成酶,还包括一些修饰酶类,如O-甲基转移酶lcsG、细胞色素P450、ABC转运蛋白、转录因子、氨基转移酶、硫酯酶、Acyl-CoA连接酶、tRNA合成酶等。对脂肽类化合物合成途径中的关键酶PKS(lcsC)、连接酶(lcsD)和硫酯酶(lcsE)分别进行了基因敲除,获得了敲除突变体ΔlcsC,ΔlcsD和ΔlcsE。对野生型以及突变体菌株的发酵液粗提物进行HPLC比较分析,发现在Δlcs C,ΔlcsD和ΔlcsE的发酵液中,leucinostatin A和B是缺失的,其HPLC谱与ΔlcsA一致,确定了这几个酶在leucinostatins生物合成过程中的关键作用。通过对lcs基因簇内特异性转录因子lcs F的过表达,提高了leucinostatins的产量,也确定了转录因子lcsF对于整个基因簇的调控作用。据此推导了leucinostatins的合成途径:在PKS的催化作用下,乙酰CoA分子和丙二酸单酰Co A分子合成了短脂肪酸链4-甲基-六碳-2-烯酸;在连接酶(lcsD)和硫酯酶(lcsE)的催化作用下,4-甲基-六碳-2-烯酸连接到NRPS合成酶Lcs A的第一个模块的第一个结构域上。Lcs A具有10个模块,能够激活10个氨基酸,在C结构域的催化下,这些氨基酸缩合为多肽链。Lcs A C末端的R结构域负责中间代谢产物多肽链的释放。中间代谢产物经过转胺、羟基化以及不同程度的甲基化等修饰步骤后,最终形成了leucinostatin A和B。野生型淡紫拟青霉(PLBJ-1)与马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)和辣椒疫霉病菌(P.capsici)进行对峙培养,P.infestans和P.capsici菌落的生长受到抑制;leucinostatins缺失的ΔlcsA与P.infestans和P.capsici对峙培养,这两株卵菌生长的抑制作用消失;leucinostatins过表达的菌株OE::lcs F与卵菌对峙培养,抑制作用增强。这些结果说明了淡紫拟青霉能够抑制卵菌的生长,这种抑制作用主要是由于leucinostatins的存在而产生的。综上所述,本研究对两个淡紫拟青霉菌株进行了基因组测序,通过与其他真菌的比较基因组分析,揭示了淡紫拟青霉的基因组特征。通过淡紫拟青霉的遗传转化体系,对次级代谢产物相关基因进行了基因敲除与功能鉴定,确定了leucinostatins的合成酶基因,并且对合成途径进行了推导。簇内转录因子的过表达确定了lcsF对整个基因簇中基因表达的调控作用,同时提高了leucinostatins的产量。此外,通过淡紫拟青霉与卵菌的对峙培养,确定了淡紫拟青霉对卵菌生长的抑制作用,缺失leucinostatins的菌株对卵菌的抑制作用消失,证明leucinostatins对卵菌具有生物活性。
【图文】：

淡紫拟青霉,孢子形态,分生孢子梗,菌落

图 1.1 淡紫拟青霉的菌落、分生孢子梗及孢子形态Figure 1.1 The colonies, conidiophores and conidia morphology of P. lilacinum.青霉的菌落形态；B，孢子及菌丝的显微照片，，标尺为 10 μmmorphology of four P. lilacinum strains; B, Microscopic conidiophores and conidia of P. lilacinum. Scale bar = 10紫拟青霉对线虫的生防作用，科研工作者致力于把淡紫拟青霉开发为有效的生防菌剂。淡紫拟青霉对了很好的防治作用。李芳等用麦粒培养淡紫拟青霉，进行防治烟草爪哇

真菌来源,次级代谢产物

1.4 真菌次级代谢产物的合成与调控次级代谢产物是针对初级代谢产物而言的，分子质量较小，一般具有广泛的生物活性，通在生物体生长发育的某一个阶段产生，在生物体内并不是必不可少的。Harold Raistrick 是真菌级代谢产物生物合成研究的先驱，他从 20 世纪 20 年代开始进行研究，鉴定了二百多种代谢物1929 年青霉素（Penicillin）的发现让真菌次级代谢产物受到广泛关注。对于次级代谢产物合成调控的研究，有助于开发新的活性化合物，提高活性化合物的产量。根据真菌次级代谢产物的生理活性，可以将其分为动植物毒素、生长调节剂、药物等几类从化学结构的角度，可以分为聚酮类化合物、非核糖体肽、萜类化合物和生物碱几类。1.4.1 聚酮类化合物的生物合成聚酮类化合物（Polyketide）这一大类物质是在真菌中广泛存在的天然化合物，由不同类型碳骨架组装而成，这些碳骨架由短链羧酸单位组成，主要包括醋酸盐、丙酸盐和丁酸盐等。真的次级代谢产物具有高度的多样性，包括调节胆固醇的药物洛伐他汀（lovastatin）(Kennedy et1999)，肿瘤血管再生抑制剂烟曲霉素（fumagillin）(Sin et al., 1997)，致癌物质黄曲霉素（aflatox(Yu et al., 2004)（图 1.2）等。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S476

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