葡萄霜霉菌效应因子PvRxLR16和PvRxLR28功能分析

发布时间：2019-09-28 11:20

【摘要】：自然界中,病原卵菌能够分泌RxLR类效应因子到寄主细胞中操控寄主体内的生理生化过程,从而有效生长和繁殖,导致寄主感病。葡萄霜霉菌(Plasmopara viticola(Berk.and Curt.)Berl.and de Toni)是严格的活体营养专性寄生卵菌,其引起的葡萄霜霉病(downy mildew)是威胁全世界葡萄生产最严重的病害之一。本实验室利用RNA-Seq的方法从葡萄霜霉菌菌株'ZJ-1-1'中分析得到了 31个候选RxLR效应因子,然而它们在侵染寄主过程中扮演的角色尚不清楚。因此,在本研究中,我们对这些候选RxLR效应因子进行特征及功能分析,并重点研究了两个效应因子的功能及对病原菌毒性的贡献,为葡萄-霜霉菌互作机制的研究奠定理论基础。从葡萄霜霉菌菌株'ZJ-1-1'预测的31个RxLR效应因子中成功克隆了 23个,这些效应因子在不同侵染时期的表达模式主要分为四种类型。利用瞬时转化本氏烟的方法,我们发现17个效应因子能够完全抑制6种不同细胞死亡诱导蛋白(BAX、INF1、PsCRN63、PsojNIP、PvRxLR16和R3a/Avr3a)激发的程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)反应,表明被研究的这些效应因子大多数具有广谱抑制PCD的功能。在本氏烟细胞中进行亚细胞定位实验发现,16个RxLR效应因子定位于细胞核和细胞质,6个效应因子特异性定位于细胞核,仅有一个定位于细胞膜,表明细胞核是RxLR效应因子在植物体内实现功能的重要部位之一。为了明确葡萄RxLR效应因子对植物先天免疫的影响,我们选择了表达时间最早,表达量最高,并且能够广谱抑制PCD的PvRxLR28进行深入研究。瞬时表达实验结果表明,蛋白的C端是其功能结构域,抑制PCD的功能依赖于细胞核定位。瞬时和稳定表达研究结果显示,PvRxLR28能够显著性提高葡萄和本氏烟对病原菌的感病性,同时还降低了转基因植株中活性氧的含量和抗病相关基因的表达量。表明PvRxLR28可能是作为PCD广谱抑制因子操控植物的免疫反应。PvRxLR16是唯一能够激发本氏烟细胞死亡的效应因子,特异性定位于植物细胞核。我们对它的不同缺失突变体、点突变体和定位突变体进行功能分析,发现W/Y/L结构域、预测的糖基化位点Asn-240及核定位对于引起细胞死亡的功能是必需的。利用病毒介导的基因沉默(VIGS)方法验证了PvRxLR16被本氏烟识别激发细胞坏死是通过ETI途径中SGT1、Hsp90和RAR1介导的,而不依赖于PTI反应中的Serk3。运用同样的方法,发现MAPK级联反应中的激酶和转录因子也参与了 PvRxLR16被识别的信号通路。瞬时表达PvRxLR16还能够激发本氏烟活性氧的积累和抗病相关基因的表达从而提高对辣椒疫霉菌的抗性。然而,PvRxLR16激发的这些防御反应又能被其他的PvRxLRs所抑制,表明在自然条件下它可能不会激发植物免疫反应。通过酵母双杂交(Y2H)技术筛选出了 PvRxLR16在葡萄中的靶蛋白VaCUE,并利用双分子荧光互补(BiFC)和免疫共沉淀技术(Co-IP)加以验证。研究发现,二者互作也依赖于PvRxLR16的W/Y/L结构域和三个预测糖基化位点。VaCUE表达受到葡萄霜霉菌的诱导,但是具体功能以及受PvRxLR16调控机制还需进一步研究。
【图文】：

御信号转导（Ｃｏｌｌｉｅｒ邋ａｎｄ邋Ｍｏｆｆｅｔｔ，邋２００９）。它们之间识别的分子机制一直是植物与病原菌互作的研究逡逑热点。在过去的十几年中，大量的研巧人员致力于探索病原菌基因是如何被植物基因识别逡逑的。研巧表明，病原菌与寄主之间的识别机制主要分为直接和间接两种方式（图１－２），而互作模逡逑式可Ｗ分为Ｗ下几种；逡逑１．２．１经典受体－配体模式逡逑该模式认为，植物Ｒ蛋白（受体）与病原菌Ａｔ基因的编码产物（配体）直接相互作用，触逡逑发侵染位点细胞内的信号传递过程，从而激发寄主植物的防卫反应产生抗病性（Ｇａｂｒｉｅｌ邋ａｎｄ邋Ｒｏ抵，逡逑１９９０）。这种直接识别模式在真菌与植物互作中发现较多，例如水稻抗病蛋白Ｐｉ拉的Ｎ端ＬＲＲ结逡逑构域能够直接与稻遍菌Ａｖｒ－Ｐｉｔａ效应因子互作，激活下游信号传导通路，从而诱导植物产生抗病逡逑反应。而该ＬＲＲ结构域中一个关键氨基酸的突变能够影响二者识别作用导致寄主丧失抗病性（Ｊｉａ逡逑Ｗａ／．，２０００）。亚麻抗镑病基因Ｌ５、Ｌ６和Ｌ７能与亚麻铸菌无毒基因直接互作激活免疫反逡逑应（Ｄｏｄｄｓ邋ｗａ／．，２００６）。后期研巧发现，将ＡｖｒＬ５６７蛋白晶体结构表面的几个氨基酸突变之后会破逡逑坏其与抗病蛋白的互作（Ｗａｎｇ幻ａ／．，２００７）。另外，亚麻抗病蛋白Ｍ同样是Ｗ直接互作的方式与亚逡逑麻诱菌效应蛋白ＡｖｒＭ互作（Ｃａｔａｎｚａｒｉｔｉ邋Ｗ邋ａ／．

图１－３葡萄霜霉病的危害及葡萄霜霉菌的形态特征（Ｇｃｓｓｌｅｒｗａ／．．２０Ｕ）逡逑Ｆｉｇｕ代邋１－３邋Ｄａｍａｇｅ邋ｏｆ邋ｇ巧ｐｅｖｉｎｅ邋ｄｏｗｎｙ邋ｍｉｌｄｅｗ邋ａｎｄ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ邋ｏｆ邋Ｐ邋ＷｎＶｕ／ｕ逡逑（Ｇｅｓｓｋｒ邋ｅ？邋ｆｌ／．，２０Ｕ邋）逡逑霜霉菌形态特征及致病过程逡逑霉病的病原菌是葡萄单轴霜霉［／Ｖａｓｗｏｐｗｏ邋ｖｖＹ／＇ｃｏ／ｆｌ＾ｅｒｋ．邋＆邋Ｃｕｒｔ．）邋Ｂｅｒｌ．邋＆邋ｄｅ邋Ｔｏｎｉ］，卵菌纲，霜霉目，单轴霉属（Ｇｅｓｓｌｅｒｅ／曰／．，２０１１）。该病原菌是二倍体活体营养型能够在葡萄细胞间扩展蔓延，通过形成球状吸器深入到植物细胞内吸取营养物质簇生，成束从叶片远轴面的气孔伸出，大小为４００－７８０邋ｎｍｘ６－ｎｎｍ，单轴近直角般为２－３次，分枝末端有２－３个圆锥形小梗，末端纯，小梗上着生着抱子囊（董子囊无色，单胞，卵形或楠圆形，有乳状突起。在条件适宜的情况下，抱子囊萌发抱子（王叶|!和李云，１９８８）。游动抱子肾脏形，扁平端侧生两根鞭毛，能在水中，抱子游动半个小时后鞭毛开始收缩直至变成圆形而停止活动（Ｋｉｅｆｅｒ邋ｅ／ａ／．，，２００２１５分钟后圆形抱子开始萌发产生芽管，从葡萄叶片背面气孔侵入体内。在侵染病原菌开始有性生殖，在其侵染发病部位形成卵抱子，卵抱子褐色、近球形、外起伏。其存活时间可长达数年，第二年春天温度达到ｉｒｃ后，在一定湿度下卵
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S436.631

【参考文献】

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3 霍立强;张建发;王素娟;;葡萄病害的发生及防治方法[J];现代农村科技;2011年01期

4 王庆华,尹小燕,张举仁;植物的基因对基因抗病性学说[J];生命的化学;2003年01期

5 郭小侠,唐周怀,陈川,石晓红,石勇强;我国葡萄几种主要病害的研究现状[J];陕西农业科学;2002年11期

6 王文辉,王志华,张志云;世界葡萄发展趋势及产销概况[J];北方果树;2001年03期

7 宋润刚,张亚凤,李昌禹,路文鹏,屈慧鸽,王军;山葡萄品种(品系)对霜霉病抗性的研究[J];北方园艺;1998年Z1期

8 肖悦岩;预测预报准确度评估方法的研究[J];植保技术与推广;1997年04期

9 王叶筠,李云;葡萄霜霉病的发生与防治[J];新疆农业科学;1988年03期

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本文编号：2543299