热应激刺激小鼠垂体的蛋白组学研究

发布时间：2019-09-29 08:26

【摘要】：高温对动物生理调节及生物大分子结构的稳定性具有显著影响;此外,温度在限制物种地理分布方面也发挥重要作用。热应激(HS)是由于高温引起的一系列动物机体障碍,主要包括热痉挛,热损伤和热休克。研究表明,了解热应激相关生理机制对于区别生理性和病理性热损伤非常重要。热应激损伤受到炎症反应和自身稳态修复的双重调节。一般而言,热应激导致动物体温升高,心率加速和大量出汗,进而影响生产性能。本试验以雄性小鼠为动物模型,研究了热应激对小鼠生理参数以及垂体蛋白表达的影响,详述如下:1-热应激对小鼠行为和生理参数的影响本试验探究热应激对小鼠行为和生理参数的影响,包括行为、体重、饮水量、采食量和直肠温度。试验以36只成年雄性小鼠(体重约50g)为研究对象,随机分为3组(A、B和C),每组12只。其中,A、B两组为热应激组,分别于30℃和40℃进行热应激处理2 h/d,为期15天;C组为对照组,在室温下(25℃)饲养。试验期间,连续监测小鼠直肠温度,每天记录采食量和饮水量,并测量热处理前后的体重变化。研究发现,热应激引起了小鼠显著的行为变化,表现为:热处理时皮毛粗糙、油腻,并产生逃逸行为,如为逃避高温咬笼子线。生理参数测定发现:B组小鼠直肠温度升高(36.57±0.57到38.01±0.45℃),但与A组相比,差异不显著;两试验组小鼠饮水量显著增加;B组小鼠体重由46.86减轻到42.15±3.55g,A组小鼠体重由46.06减少至44.68±5.01g,差异显著;各组间采食量无显著差异。上述结果表明:热应激诱导小鼠产生逃逸行为,使直肠温度及饮水量上升,体重降低。2-热应激对小鼠激素水平和睾丸组织形态的影响本试验探究热应激对小鼠内分泌功能的影响。小鼠被随机分为3组,每组12只,A组和B组分别每天在30℃和40℃条件下两小时,持续15天,C组一直在室温(25℃)条件下作为对照组。第7天和第15天热处理后采集血样,离心后收集血清保存,利用放射免疫测定法对促肾上腺皮质激素(ACTH)、睾酮及生长激素含量进行检测。结果表明,两处理组血清睾酮水平在第15天时显著下降;生长激素含量在第7天时较低,但与其第15天时的含量无显著差异。与对照组相比,热应激组小鼠ACTH含量在第7天时显著降低,第15天时ACTH含量略有增加。此外,热应激对睾丸组织形态的影响也进行了检测。采集睾丸组织后,福尔马林固定,酒精梯度脱水,常规石蜡包埋,制成5μm切片。苏木精-伊红染色(HE)发现,高温(40℃)严重损害睾丸组织。在4℃应激组小鼠的曲细小管萎缩,精子含量少,睾丸变性,曲细精管排列不规则,生精阻滞和睾丸间质细胞萎缩。综上,这些结果表明,热应激导致雄性小鼠激素失衡,繁殖性能下降,可能影响精子发生而造成不育。3- iTRAQ分析热应激对小鼠脑垂体蛋白表达的影响本试验利用iTRAQ芯片技术分析热应激小鼠垂体的蛋白反应。试验对垂体中的564种蛋白质进行了检测。结果表明,与对照组(RT)相比,40℃热应激组共有374种蛋白质表达差异,其中,89种蛋白上调,285种下调。在564种蛋白质中,已确定与应激有关的蛋白有130种,其中有26种蛋白表达上调,46种蛋白下调。7种热休克蛋白表达差异显著:其中,2种蛋白属于HSP70家族、1种蛋白属于HSP90家族,它们显著上调;而HSP90和HSP84b的表达均下调。HSP70(HSPAlB)和NMNAT3显著高表达,达到对照组的6.9和6.64倍。而中间丝相关蛋白家族(IP)包括,核纤层蛋白(prelamin-a/C和核纤层蛋白B)、波形蛋白、角蛋白均表达上调。在这里,中间丝蛋白和热休克蛋白作为生物标志物证实了热应激与蛋白质水平变化相关联。热应激时,小鼠垂体A-IV表达水平上调,这可能与热应激期间低采食量有关。此外,我们将差异表达蛋白进行了功能富集。结果发现,上调蛋白中,37个蛋白与刺激反应相关,其中26个与应激有关;下调蛋白中,99个蛋白与刺激反应相关,其中46个与应激有关。同时,试验利用RT-PCR技术对6个热休克蛋白的表达在转录水平进行验证,结果表明,HSP70基因表达水平显著上调(hsp1b),与蛋白质组学结果一致。HSPa5, HSP84b和HSP 90B基因mRNA表达水平没有变化,而HSP90A mRNA的表达与蛋白芯片结果一致。为了进一步验证芯片结果,试验利用western blot技术测定了4个差异表达蛋白的含量。结果显示,与对照组相比(RT) , 40℃组小鼠垂体中NMAT3和HSPlab表达上调,而HSP60和HSP90a表达下调,可能与肌动蛋白的内部控制有关。这些结果从转录和蛋白表达两个水平上验证了iTRAQ蛋白芯片的准确性。综上结果表明,这些差异表达的蛋白质可能在缓解热应激方面起到重要的作用。
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.3

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本文编号：2543827