家蚕Ferritin-1的重组表达及功能分析

发布时间：2019-09-30 17:05

【摘要】：昆虫免疫反应包含由IMD和Toll通路介导的抗菌肽的表达、酚氧化酶催化的黑化反应以及血细胞介导的免疫反应。家蚕被驯化已经5000多年,为中国重要的经济产业之一。并且家蚕是首个完成全基因组测序的鳞翅目昆虫。因此,家蚕是昆虫学研究的重要的鳞翅目模式之一。铁离子是一个重要的元素,为细胞代谢所必需,参与细胞和机体的多个代谢途径和反应。细菌侵染影响铁离子在昆虫体内的含量与分布,这为理解细菌和昆虫的相互作用提供了重要的线索。铁蛋白(Ferritins)和转铁蛋白(Tranferrins)是两类主要的铁结合蛋白,维持着昆虫体内的铁稳态。铁蛋白存在于古细菌、细菌、植物和无脊椎动物中。它具有一个空心球体结构,含有24个亚单位。转铁蛋白具有抗氧化和抗细菌的能力。家蚕铁蛋白1(BmFer1)基因含有三个内含子,在5’非翻译区有一个铁离子响应原件。BmFer1重链结构域(HCH)与鱼、甲壳动物及其他昆虫的氨基酸序列比对发现铁氧化酶活性区域必需的7个氨基酸残基高度保守。进化分析结果显示昆虫的HCHs聚为一支。为检测BmFer1是否参与对抗细菌感染,我们首先用两种细菌感染家蚕(革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureu和革兰氏阴性菌绿脓杆菌Pseudomonasaeruginosa),然后检测家蚕血淋巴中铁离子含量以及家蚕体内铁蛋白的转录水平。结果发现,细菌侵染强烈地引起家蚕体内铁离子浓度的上升,BmFer1在血细胞中的转录受到强烈诱导。为了进一步探究BmFer1的生理功能,我们在大肠杆菌中表达了BmFer1,并纯化得到重组蛋白。聚丙烯凝胶电泳和免疫印迹分析确认了重组蛋白及其纯度。铁鳌合实验显示重组BmFer1具有结合铁离子的能力,且与浓度呈正比。此外,将重组BmFer1注射到家蚕体内能够降低由于细菌感染引起的铁离子浓度的升高,说明BmFer1在血淋巴中鳌合铁离子。我们进一步检测了铁离子对细菌生长的影响。结果表明,Fe2+能够促进细菌的生长,而且绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌对铁离子的敏感度不同。绿脓杆菌的生长在Fe2+浓度为0到64μM的时候被促进,对更高浓度的Fe2+不敏感；而金黄色葡萄球菌的生长则在铁离子浓度为16 μM的时候就不再被促进。由于注射重组BmFer1可以减轻细菌的感染程度,我们发现在注射细菌8小时后,家蚕体内的活细菌数目明显少于对照组。此外,BmFer1能够降低家蚕由于细菌感染引起的死亡率,表明BmFer1能够起到对抗细菌侵染的作用。由此我们得出：细菌依靠铁离子来维持生长,而BmFer1则通过限制细菌对自由铁离子的摄取从而阻碍细菌的生长。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S881.2

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本文编号：2544384