α螺旋抗菌肽与α防御素4抗病原微生物活性及作用机制研究

发布时间：2020-01-21 00:37

【摘要】：抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)作为广谱抗菌、抗病毒且不易引起耐药的小分子多肽药物受到广泛重视,在医学、农业、材料等领域开展了大量应用研究。现阶段我国养猪业面临着耐药菌株不断出现、病毒病流行等困扰,研究可抑制病原复制的新型制剂,具有重要现实意义。因此本研究选取α螺旋抗菌肽cecropin B,moricin,piscidin,caerin,maculatin和其它结构的lactoferricin B,indolicidin作为代表,研究其对猪场常见病原的抑制活性及作用机制。进而以HNP4作为代表性多肽,研究其结构与功能关系,为进一步解析其作用机理奠定基础。主要研究结果如下:1.cecropin B和moricin对猪场常见病原菌的抗菌活性及作用机制研究筛选具有抗菌效果的抗菌肽:通过对副猪嗜血杆菌、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌和猪链球菌等八种猪场常见细菌的抗菌活性研究,发现moricin对所有病原菌均具有抑制作用,而cecropin B对革兰氏阴性菌有更强烈抑制作用。通过杀菌曲线发现二者能够在短时间内杀灭所有细菌。细菌疏水性、电荷性与对cecropin B敏感性之间的关系:测试了cecropin B对副猪嗜血杆菌标准菌株及部分临床菌株的抑制作用,发现均具有较好的活性(MIC为2μg/ml-16μg/ml)。通过十六烷吸附试验和电泳试验研究了不同菌株膜表面的疏水性和电荷性,与其对cecropin B的敏感性之间建立关系,发现疏水性越强和带负电荷越多的菌株对cecropin B越敏感。抗菌肽cecropin B引起副猪嗜血杆菌形态学变化的观察:利用透射电子显微镜(TEM)、扫描电子显微镜(SEM)和原子力显微镜(AFM)等手段观察细菌形态变化。发现cecropin B能够损坏细菌膜导致质膜分离、内容物外泄和中空细胞等现象。同时可以观察到致密电子点形成等细菌内部结构改变。表明抗菌肽能作用于细菌膜结构,同时也有可能作用于细菌内靶位点。研究结果表明cecropin B可作为候选的抗革兰氏阴性菌药物开发。2.抗菌肽对猪源病毒的抑制活性和作用机制研究抗病毒多肽的筛选:由于moricin和cecropin B对病毒抑制作用不明显,根据报道重新选取了五种不同来源的抗菌肽piscidin,maculatin,caerin,lactoferricin B,indolicidin对伪狂犬病毒(PRV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)和轮状病毒(RV)进行抗病毒活性研究。TCID50测定piscidin,maculatin,caerin对大部分病毒抑制作用较强,抗病毒活性与其浓度呈正比。piscidin和caerin处理PRV后的病毒存活率仅为2%,作用最强,并可抑制不同伪狂犬病毒毒株。抗菌肽对PRV复制过程的抑制研究:通过病毒感染前多肽处理细胞、病毒感染后多肽处理细胞以及多肽直接处理病毒粒子三种方式,研究抗菌肽对病毒复制阶段的影响。发现maculatin,caerin和piscidin均直接作用于病毒粒子。通过非线性回归分析计算IC50,表明多肽对PRV的抑制活性从高到低为piscidinmaculatincaerin。细胞凋亡检测发现抗菌肽能够显著抑制病毒引起的细胞凋亡。用小鼠作为模型,测定piscidin抗PRV感染的能力:通过小鼠试验,发现piscidin在低至2.5μg/ml浓度时仍能杀灭PRV,对小鼠提供90%的保护,并且在大于5μg/ml浓度时就能够完全保护小鼠免受PRV致死性感染。这表明piscidin可以作为抗病毒药物进行开发。3.HNP4的结构-功能活性研究氨基酸和结构改变对HNP4抑菌活性的影响:首先合成、纯化出高质量HNP4及突变体,通过抑菌试验发现HNP4对E.coli的抑制活性强于对S.aureus的抑制作用。所有HNP4精氨酸突变体对E.coli和S.aureus的活性均比HNP4低很多。但是对HNP4影响最大的是位于26位的苯丙氨酸。其相对应的突变体F26A-HNP4对S.aureus的抑制作用几乎完全丧失,但对E.colli的抑制作用没有影响。二聚对HNP4抗革兰氏阴性菌活性影响不大,但其革兰氏阳性菌抑制活性下降约3倍。因此HNP4很有可能是采取两种不同的机制来抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。氨基酸和结构改变对HNP4抑制炭疽杆菌致死因子(LF)活性和结合gp120活性的影响:通过非线性回归分析,发现同抑菌试验结果类似,26位的苯丙氨酸对HNP4的活性影响最大,精氨酸次之。HNP4的单体Me Leu20-HNP4对LF和gp120结合能力也明显下降。上述研究结果表明对HNP4功能影响最大的是26位苯丙氨酸,其次是精氨酸。二聚也会影响HNP4的部分功能。总之,本研究发现了能抑制副猪嗜血杆菌和伪狂犬病毒的抗菌肽cecropin B和piscidin。同时通过HNP4结构-功能关系研究,发现了对HNP4功能活性影响最大的苯丙氨酸和精氨酸,获得了研究抗菌肽结构-功能关系的技术方法和思路。为进一步研制抗猪源病原微生物的新型制剂及临床应用打下基础。
【图文】：

1 个氨基酸组成的 BuforinⅡ在数倍于 MIC 浓度时，不裂解细菌膜而杀通过 FITC 标记发现 BuforinⅡ在较低浓度下就能跨过细菌膜并在胞质凝胶阻滞试验发现 BuforinⅡ能与核酸互作，并且活性比采用膜作用机Figure 1-2 Models for AMPs interacting with intracellular targets

图 1-3 抗菌肽不同的抗病毒机制(Mulderet al 2013)Figure 1-3 Different models displayed by AMPs against viruses非脊椎动物的抗菌肽：此类多肽如 melittin, alloferon 和 cecr种病毒具有强烈抑制作用。研究表明 melittin 对 HIV-1 感染
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S859.7

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本文编号：2571416