黄瓜CsABC19和CsPDR响应霜霉威胁迫的功能分析

发布时间：2020-01-22 18:05

【摘要】：黄瓜作为世界蔬菜生产的重要栽培作物,因其味道清香、口感爽脆,深受人们喜爱,在市场消费中占有重要地位。然而黄瓜在生产过程中经常受到多种病害和虫害的危害,严重影响产量或者品质,其中黄瓜霜霉病的影响最为严重。霜霉威(propamocarb,PM)是一种可以有效控制黄瓜霜霉病的杀菌剂,主要以喷施方式进行防治,病害得到防治的同时,也会使霜霉威在黄瓜体内产生残留。近年来,随着生活质量的提高,人们越来越重视食品安全问题,尤其是农药残留。因此,黄瓜低农药残留性的研究,不仅可以有效减少农药使用量,降低生产成本,减少对环境的污染,还能更好地防止对人体健康的危害。ABC转运蛋白基因在植物解毒代谢中起着重要的作用,参与多种抗逆反应。本研究选取黄瓜低残留品系D0351和高残留品系D9320为研究对象,克隆了2个ABC转运蛋白基因,并在生物信息学分析、表达模式分析、遗传转化验证等方面展开了研究,主要结果如下:(1)基于低霜霉威残留品系D0351霜霉威胁迫处理的转录组数据,得到29个差异表达ABC转运蛋白基因,进化分析表明这些ABC转运蛋白基因分别属于5个ABC亚家族的成员,包括ABCB 6个、ABCC 7个、ABCG 10个、ABCF 2个、ABCI 4个。(2)利用q RT-PCR技术分析了黄瓜CsABC19、Cs PDR和Cs MRP基因经霜霉威胁迫后的表达情况,发现在低残留品系D0351和高残留品系D9320中,受霜霉威胁迫Cs ABC19转录水平分别呈现诱导上调和下调,CsPDR转录水平均呈诱导上调,而CsMRP转录水平均呈诱导下调。霜霉威处理下不同时期不同组织表达分析表明,黄瓜Cs ABC19和Cs PDR基因在低残留品系D0351中被诱导表达增加的倍数要高于高残留品系D9320,并且其能快速响应霜霉威信号,能够在霜霉威胁迫初期发挥重要作用。(3)不同组织的表达分析结果显示黄瓜Cs ABC19和Cs PDR基因呈组成性表达,且具有组织差异性和品种差异性,D0351的生殖器官中(果皮、果肉、雌花和雄花)表达量高于D9320,相反,营养器官中(叶片、茎和根)表达量低于D9320。(4)克隆了黄瓜CsABC19和CsPDR基因,分别属于ABCF亚家族和ABCG亚家族,多序列比对结果表明,Cs ABC19与其他植物ABC蛋白的氨基酸序列在Walker A、Walker B以及ABC标签基序处高度保守;CsPDR基因编码的蛋白具有全转运子结构,包含2个跨膜结构域(trans-membrane domains)和2个核苷酸结合区域(nucleotide binding domains);启动子序列预测分析发现,存在调控真核基因转录的基本元件和一些与激素及胁迫诱导等相关的调控元件。同时构建了Cs ABC19和CsPDR基因过表达载体。(5)利用农杆菌介导法将构建的Cs ABC19基因植物过量表达载体导入拟南芥,获得转基因纯合株系,进一步对转基因及野生型进行霜霉威和糖胁迫处理,结果表明,Cs ABC19基因提高了转基因植株对霜霉威和糖胁迫的适应性和耐性,并且使转基因植株的霜霉威残留量有所降低。(6)成功构建Cs ABC19基因与绿色荧光蛋白(GFP)的融合表达载体,通过绿色荧光蛋白(GFP)瞬时表达系统分析检测,CsABC19基因在细胞核、细胞膜及细胞质中表达。(7)研究了黄瓜649和D9320品种对Kan的敏感性。黄瓜649和D9320的Kan不定芽诱导选择压浓度分别为75mg/L和50mg/L,根诱导选择压浓度均为50mg/L。最佳侵染时间为20min,最佳共培养时间为3d。(8)获得转Cs ABC19基因黄瓜株系5株,检测为阳性植株。
【图文】：

生物体

图 1-1 不同生物体的 ABC 转运蛋白Fig. 1-1ABC transporter proteins in allorganisms1.1.4.1 ABC 转运蛋白结构及作用机理ABC 转运蛋白一般都存在跨膜结构区域（transmembrane domain，TMD）和核苷酸结合区域（nucleotide binding domain，NBD），其中每个 NBD 含有 3 个高度保守的特征基序（WalkeA 盒［GXXGXGKS/T］［(RK) X3GX3L (hydrophobic)3］和 Walker C）ǎNBD 能够结合并水解 ATP，而 TMD 进一步利用水解 ATP 产生的能量，选择底物完成跨膜转运ǎABC 转运蛋白可以在不同生物体内找到，并且它们的结构相似程度大，NBD 保守性高，也就使得它们的作用机制也具有一定的相似性ǎ目前，ABC 转运蛋白作用机理可以用一种门控模式的说法加以解释说明，此种说法也能够被人们接受ǎ当 ABC 转运蛋白具有膜外结合蛋白时，TMD 形成运输通道，，底物被转运之前，外周质的门呈现开放状态，向胞质面的门呈现关闭状态ǎ当膜外结合蛋白与底物结合时，信号传递到 NBD，使 NBD 发生结合同时水解产生 ATP，引起 TMD构象变化，使底物分子完成跨膜转运[41-44]ǎ1.1.4.2 ABC 转运蛋白的进化在拟南芥中，ABC 转运蛋白包含 13 个亚家族，并且其结构域组织形式多样化，其中全分子的 ABC 转运蛋白包含 4 个典型的结构域，以正向方式（TMD-NBD-TMD-NBD）连接的

拟南芥

图 1-2 拟南芥 ABC 转运蛋白概述Fig. 1-2 Overview of the ArabidopsisABC transporters1.1.5 基因功能分析方法随着生命科学的发展及研究领域的不断开拓，生物和生命科学的研究已转向分子水平，并且研究内容也不断深入和推进，进而获得的未知新基因也越来越多，对基因新功能的研究开展地越来越迅速，新基因的成功克隆也为基因功能研究提供了重要条件，因此对新基因功能的研究显得日益重要，这也是后基因组时代功能基因组学的重要研究内容和首要任务[77]ǎ1.1.5.1 促使基因表达基因功能研究的功能获得可以通过将新基因直接导入到某一细胞或个体中，促使基因的表达，通过对细胞的生物学行为变化加以观察，或个体表型遗传性状发生的改变来判定和确定基因的功能，可以利用基因瞬时表达过量表达和异源表达等方法ǎ基因过量表达（Gene overexpression），首先将获得的目的基因全长序列与高活性的组成型或组织特异性启动子融合，然后利用转化方法，使该基因整合到植物或动物基因组中，进而获得基因产物大量积累的个体ǎ基因超表达技术能够控制外源基因在时间空间或特定组织中的表达，可以对基因功能进行系统性的研究ǎSu 等[78]的研究表明，AGL15 超表达可以
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S436.421.11

【参考文献】