旋毛虫组织蛋白酶F的功能鉴定及药物靶标筛选

发布时间：2020-02-06 03:05

【摘要】：旋毛虫病是由旋毛虫感染引起,是一种再度肆虐流行的疾病,旋毛虫肌幼虫入侵宿主且形成适应厌氧环境的包囊,这可能是旋毛虫的正选择基因以及旋毛虫基因组与其余线虫基因组中存在差异基因而导致。正选择基因在进化中具有非同义替代率高于同义替代率的特性,可通过已存在的基因随意突变而改变基因功能,从而使寄生虫适应宿主环境,此外旋毛虫基因组与其余基因组存在差异也可能是旋毛虫适应宿主环境的另外一种机制,因此本研究分析了旋毛虫与不同的蠕虫物种之间的部分差异基因和正选择基因。半胱氨酸蛋白酶是寄生性蠕虫的重要毒力因子,可能作为一潜在抗蠕虫药物靶标和疫苗候选抗原。旋毛虫通过机械作用、酶水解来入侵宿主肌纤维,半胱氨酸蛋白酶是否在入侵中具有作用,仍属未知。组织蛋白酶F属于半胱氨酸蛋白酶家族,旋毛虫组织蛋白酶F在NCBI中初步筛选显示在旋毛虫中是多基因家族,其生物学特性未知,因此我们对旋毛虫组织蛋白酶F家族基因进行研究。本研究以旋毛虫基因组与马来丝虫、猪鞭虫、锡兰钩口线虫和秀丽隐杆线虫基因组作为对照,采用CODEML软件鉴定旋毛虫的正选择基因,结果显示鉴定出986个正选择基因,旋毛虫正选择基因可解释其对宿主厌氧环境的适应性,鉴定的正选择基因对于药物和疫苗研发具有潜在作用;采用blastn进行差异基因组研究,将旋毛虫与人类、锡兰沟口线虫、广州管圆线虫、罗阿线虫、猪蛔虫、美洲板口线虫、马来丝虫、彭亨氏线虫、犬弓首蛔虫、秀丽小杆线虫、秀丽隐杆线虫、鼠鞭虫、犬恶心丝虫、猪鞭虫、捻转血矛线虫、人鞭虫、棘球蚴、曼氏血吸虫中的半胱氨酸蛋白酶家族进行比较,结果显示组织蛋白酶F、组织蛋白酶B、组织蛋白酶L、肠道特异性半胱氨酸蛋白酶、二肽基肽酶在不同物种之间存在差异。成功克隆了TsCF1、TsCF2、TsCF3基因,TsCF1、TsCF2、TsCF3基因片段分别编码366 aa、496 aa和365 aa。将去除信号肽基因与pET30a表达载体连接得到重组质粒随后进行原核表达,表达获得的重组蛋白分别大小为TsCF1重组蛋白大小为45.00 kDa,TsCF2重组蛋白大小为58.29 kDa,TsCF3重组蛋白大小为43.94 kDa。将纯化的rTsCF1、rTsCF2和rTsCF3免疫家兔后,获高免血清。免疫印迹实验显示TsCF1、TsCF2和TsCF3在旋毛虫肌幼虫粗抗原、排泄分泌抗原以及成虫粗抗原中均存在;免疫组化显示TsCF1定位于表皮和杆状体、TsCF2定位于生殖原基、TsCF3定位于后肠、表皮和杆状体中。抗体阻断实验显示与对照组相比,经TsCF1、TsCF2和TsCF3抗血清处理过的肌幼虫攻击小鼠35天后,肌幼虫减虫率分别为54.38%、23%和48%,经TsCF1、TsCF2和TsCF3抗血清处理过的肌幼虫攻击小鼠5天后TsCF1、TsCF2和TsCF3组与对照组相比成虫减虫率分别为62.5%、50.6%和55.67%,显示TsCF1、TsCF2和TsCF3对虫体生存具有显著作用,推测TsCF家族蛋白具有胚胎致死性;采用TsCF1、TsCF2、TsCF3和TsCF1、TsCF2、TsCF3混合蛋白进行免疫,在最后一次免疫后2周进行攻虫实验,与对照组相比,上述各组的减虫率分别为23.24%、21.28%、23.29%和51.72%。将rTsCF1、rTsCF2和rTsCF3复性后,采用针对组织蛋白酶F的特异性底物Z-Phe-Arg-AMC研究重组TsCF1和TsCF2在pH为5.5时的酶活性实验和抑制实验,显示rTsCF1的Km为0.5091μM,Vmax为6.12 RFU/sμM,E64可强有效抑制rTsCF1活性,其IC50为135.50±16.90 nM;rTsCF2的Km为2.016μM,最大速度Vmax值为5.72 RFU/sμM,E64也可强有效抑制rTsCF2活性,其IC50值为112.50±6.16 nM;rTsCF3无酶活性。通过虚拟对接实验研究了TsCF1、TsCF2、TsCF3与E64和K11777之间的相互作用,将旋毛虫组织蛋白酶F家族与cystatin家族进行虚拟对接,获得组织蛋白酶F家族与cystatin家族之间的最适结合构象,显示cystatin家族可与组织蛋白酶F家族之间进行结合,这部分解释了cystatin家族和组织蛋白酶F家族之间的抑制作用。将旋毛虫组织蛋白酶F家族与FDA药物库和天然代谢产物库进行对接和虚拟筛选,每个组织蛋白酶F均获得200种化合物。采用SPRi技术对TsCF1进行筛选,结果显示TsCF1与头孢地尼、呋塞米、酮洛芬、地拉罗司、舒洛芬、曲尼斯特、坎地沙坦、缬沙坦、替米考星、盐酸倍他洛尔、阿奇霉素、盐酸奎宁二水合物、阿奇霉素二水合物可特异性结合,推测上述化合物可作为体内实验和体外实验筛选的候选药物来治疗旋毛虫病。基于上述结果表明,旋毛虫组织蛋白酶F可作为治疗旋毛虫病的潜在药物靶标。
【图文】：

图 2.1 采用上表中的 56 个基因构建的系统进化树Figure 2.1 Phylogenetic tree among T. spiralis, B. malayi, T. suis, A. ceylanicum and C. elegans by using the 56genes described above.2.1.2 旋毛虫正选择基因分析对五个物种相互之间进行 BLAST 分析，且 E 值为 1×10-10，将旋毛虫、马来丝虫、猪鞭虫、兰钩口线虫和秀丽隐杆线虫中的一对一的同源基因分析，且将序列一致性超过 30%的核酸序列行筛选出，结果筛选出 1997 个同源基因。将筛选出的同源基因采用 MUSCLE （Edgar，et al.,004） 和 Gblocks（Castresana，et al., 2000），将所有的空和 N 值从比对序列中删除，来减少对续的正选择分析的干扰。采用 CODEML 软件对对每对序列的 dN/dS 值进行分析，结果显示有 986 个基因被筛选出。集分析显示在统计学上具有显著性差异的正选择的基因被聚类成为包括代谢通路（次级代谢产的生物合成，在多种环境中的微生物代谢环境，嘌呤代谢、嘧啶代谢、淀粉和蔗糖代谢、氨基和核酸核糖代谢及碳水化合物的代谢）; 与信号通路相关的通路（环磷酸腺苷信号通路、钙离信号通路和环磷酸鸟苷-蛋白激酶 G 信号通路），细胞质内的 DNA-感应通路； RNA 聚合酶和激神经组织的配体-受体相互作用等通路等（参见图 2.2）。

igure 2.1 Phylogenetic tree among T. spiralis, B. malayi, T. suis, A. ceylanicum and C. elegans by using thegenes described above.1.2 旋毛虫正选择基因分析对五个物种相互之间进行 BLAST 分析，且 E 值为 1×10-10，将旋毛虫、马来丝虫、猪鞭钩口线虫和秀丽隐杆线虫中的一对一的同源基因分析，且将序列一致性超过 30%的核酸筛选出，结果筛选出 1997 个同源基因。将筛选出的同源基因采用 MUSCLE （Edgar，4） 和 Gblocks（Castresana，et al., 2000），将所有的空和 N 值从比对序列中删除，来减的正选择分析的干扰。采用 CODEML 软件对对每对序列的 dN/dS 值进行分析，结果显示有 986 个基因被筛选分析显示在统计学上具有显著性差异的正选择的基因被聚类成为包括代谢通路（次级代生物合成，在多种环境中的微生物代谢环境，嘌呤代谢、嘧啶代谢、淀粉和蔗糖代谢、核酸核糖代谢及碳水化合物的代谢）; 与信号通路相关的通路（环磷酸腺苷信号通路、号通路和环磷酸鸟苷-蛋白激酶 G 信号通路），细胞质内的 DNA-感应通路； RNA 聚合神经组织的配体-受体相互作用等通路等（参见图 2.2）。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.7
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本文编号：2576786