弓形虫新毒力基因TgMAPK1表达特性及其初步功能研究

发布时间：2017-03-20 20:06

  本文关键词：弓形虫新毒力基因TgMAPK1表达特性及其初步功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：弓形虫是一种专性细胞内寄生原虫,它可以感染包括人类在内的几乎所有哺乳动物。弓形虫感染给世界畜牧业和人类健康都带来严重危害,作者先后对吉林省猪、锦州地区鸡、辽宁绒山羊、辽西地区宠物犬进行了弓形虫感染情况调查,发现这些地区畜禽弓形虫感染较为严重,其防治工作迫在眉睫,然而目前弓形虫病仍无较理想的防治药物和安全有效的疫苗,所以寻找新型药物治疗靶标和疫苗候选诊断抗原是当前急需解决的科学问题。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。已有研究证实,MAPKs信号转导系统可将细胞外的信号刺激转导至细胞及细胞核内,可调节诸如细胞增殖、分化、凋亡、转化以及应激反应等重要生理过程。弓形虫可编码Tg MAPK1和Tg MAPK2,Tg MAPK1是一种p38αMAPK同源物,在机体受到外界刺激时表达或在体外速殖子转化为缓殖子时表达,与虫体生长发育和致病性密切相关,是一种新的毒力因子,但其表达特性和基因功能还不完全清楚。为探究上述科学问题,本研究克隆表达了弓形虫Tg MAPK1:通过构建弓形虫Tg MAPK1原核表达载体,经IPTG诱导表达,获得重组蛋白r Tg MAPK1,免疫小鼠制备抗r Tg MAPK1的小鼠多克隆抗体,应用IFA技术检测Tg MAPK1蛋白在弓形虫速殖子的的表达部位。同时采用同源重组方法,以氯乙酰基转移酶(CAT)为筛选标记,构建弓形虫Tg MAPK1基因打靶载体;以二氢叶酸还原酶(DHFR)为筛选标记,构建弓形虫Tg MAPK1基因过表达载体;通过抗性筛选及相关鉴定,获得弓形虫Tg MAPK1缺失株和互补体虫株;应用免疫荧光、荧光定量PCR、流式细胞术和纳虫空泡试验等方法手段研究弓形虫MAPK1基因缺失后对其体内和体外基因表型变化的影响,为鉴定弓形虫病潜在药物治疗靶点及疫苗候选诊断抗原的研究奠定基础。1.弓形虫Tg MAPK1克隆、表达及生物信息学分析RT-PCR扩增Tg MAPK1编码序列,目的片段大小为1599 bp。经序列比对和遗传进化分析,弓形虫Tg MAPK1氨基酸序列与恶性疟原虫、毒害艾美尔球虫和哈雷德原虫等寄生原虫的同源性高,但与人类和哺乳动物间的同源性较低,亲缘关系较远。进而克隆表达了弓形虫Tg MAPK1:构建Tg MAPK1原核表达载体p ET-28a(+)-Tg MAPK1,重组蛋白(r Tg MAPK1)大小为58 ku。经Ni-NTA纯化后,将r Tg MAPK1免疫BALB/c小鼠制备了抗r Tg MAPK1的多克隆抗体,应用IFA技术检测Tg MAPK1在弓形虫速殖子亚细胞定位。2.体外诱导缓殖子转化时TgMAPK1的表达变化构建体外弓形虫速殖子诱导缓殖子转化模型,应用相对荧光定量QRT-PCR技术检测不同诱导条件(高温41℃,碱性p H8.1)下弓形虫缓殖子期特异性蛋白BAG1、ENO1、 SAG2D、LDH2的表达变化,判断体外诱导缓殖子的转化效果,进而检测不同诱导条件下Tg MAPK1蛋白的表达变化,明确弓形虫Tg MAPK1对诱导分化的影响。3.弓形虫Tg MAPK1缺失株及互补体虫株的构建利用PCR方法克隆弓形虫Tg MAPK1基因两侧翼非编码区,以CAT为筛选标记,构建基因打靶载体pmin CAT-Tg MAPK1-UTR;再以DHFR为筛选标记,构建弓形虫Tg MAPK1的过表达载体p DHFR-Tg MAPK1;将打靶载体线性化后电穿孔转染弓形虫Tg GT1株,经氯霉素筛选获得抗性单克隆虫株,采用PCR、RT-PCR、Southern blotting和Western blotting等方法进行鉴定。再将过表达载体p DHFR-Tg MAPK1电穿孔转染至鉴定正确的Tg MAPK1缺失株内,经乙胺嘧啶抗性筛选获得抗性单克隆虫株,再采用RT-PCR、Southern blotting和Western blotting方法进行鉴定。4.弓形虫Tg MAPK1的功能研究体外研究:在体外细胞培养状态下,应用IFA、QRT-PCR、FCS和纳虫空泡试验等方法比较弓形虫Tg MAPK1缺失株(Tg MAPK1)、互补体虫株(Tg Complement)与野生株(Tg GT1)在黏附、侵入、增殖、分化和抗原基因表达差异以及在巨噬细胞内细胞因子表达差异等试验鉴定MAPK1缺失对弓形虫基因表型变化的影响。体内研究:采用不同剂量Tg MAPK1、Tg Complement和Tg GT1的速殖子接种小鼠,统计分析小鼠的平均存活时间及存活小鼠肝、脑组织内的虫体数量,确定弓形虫MAPK1对体内致病性及增值的影响。采用BDTMCBA技术通过流式细胞仪检测比较Tg MAPK1与Tg GT1在接种小鼠后第3天和第7天时血清和腹腔液内细胞因子的表达差异,推测MAPK1基因对体内细胞因子变化的影响。综上,本研究得出以下结论:(1)序列比对及遗传进化分析显示弓形虫MAPK1与包括人源在内的哺乳动物的MAPK1亲缘关系较远,表明MAPK1基因可作为弓形虫病药物治疗的候选基因和药物作用靶点。(2)克隆并表达了弓形虫Tg MAPK1,获得了重组蛋白r Tg MAPK1及其多克隆抗体,并证明Tg MAPK1在弓形虫速殖子细胞外膜上表达。(3)体外诱导缓殖子转化时Tg MAPK1蛋白表达水平增高,且在诱导前期以及碱性诱导条件下差异显著,推测碱性条件下弓形虫的分化更依赖于MAPK1信号通路。(4)构建了弓形虫TgMAPK1基因打靶载体和过表达载体,经电转、抗性筛选及PCR、RT-PCR、Southern、Western等鉴定,成功获得弓形虫Tg MAPK1缺失株和互补体虫株。(5)体外研究表明:粘附侵入试验表明MAPK1缺失能降低弓形虫速殖子对宿主细胞的粘附能力但对侵入无影响;增殖试验表明MAPK1缺失可以减缓弓形虫速殖子的增殖;诱导分化试验表明MAPK1缺失可降低弓形虫速殖子向缓殖子的转化效力;基因表达差异试验表明MAPK1基因对弓形虫SAG3、GRA1及MICs基因的表达呈负调控作用,对ROPs基因的表达呈正调控作用。巨噬细胞内细胞因子表达差异试验表明MAPK1基因可能是通过调控TNF、IL-6、IL-10的表达而促进巨噬细胞的活化。(6)体内研究表明:小鼠体内致病性试验表明MAPK1缺失可降低弓形虫对小鼠的致病力,降低其在小鼠体内增殖速度,表明Tg MAPK1是弓形虫的一种新的毒力基因。腹腔液中细胞因子表达差异试验表明MAPK1基因可能是通过调控IL-12p70、TNF-α、IFN-γ和IL-10的表达而促进腹腔内巨噬细胞活化,进而杀灭弓形虫。血清中细胞因子表达差异试验表明MAPK1基因可能是通过调控IL-12p70、TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-10的表达而促使机体由Th2型免疫应答向Th1型的转变,从而建立潜伏感染或慢性感染。
【关键词】：弓形虫 丝裂原活化蛋白激酶1 TgMAPK1 基因敲除 基因功能
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.7
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-13
• 英文缩略表13-14
• 前言14-15
• 第一篇 文献综述15-23
• 1 弓形虫与弓形虫病15-17
• 2 MAPK的研究进展17-22
• 3 本研究的目的与意义22-23
• 第二篇 实验内容23-108
• 第一章 弓形虫MAPK1基因克隆、表达及生物信息学分析23-49
• 1.1 材料23-27
• 1.2 方法27-37
• 1.3 结果37-47
• 1.4 讨论47-48
• 1.5 小结48-49
• 第二章 弓形虫诱导缓殖子过程中MAPK1表达水平研究49-58
• 2.1 材料49-50
• 2.2 方法50-52
• 2.3 结果52-56
• 2.4 讨论56
• 2.5 小结56-58
• 第三章 弓形虫MAPK1缺失株及互补体虫株构建及鉴定58-79
• 3.1 材料58-59
• 3.2 方法59-69
• 3.3 结果69-77
• 3.4 讨论77-78
• 3.5 小结78-79
• 第四章 弓形虫MAPK1缺失对其体外生长发育的影响79-97
• 4.1 材料79
• 4.2 方法79-87
• 4.3 结果87-94
• 4.4 讨论94-96
• 4.5 小结96-97
• 第五章 弓形虫MAPK1缺失对其体内致病性的影响97-108
• 5.1 材料97
• 5.2 方法97-99
• 5.3 结果99-103
• 5.4 讨论103-106
• 5.5 小结106-108
• 结论108-109
• 参考文献109-121
• 附录121-124
• 作者简介124-125
• 致谢125

【参考文献】

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1 张爱梅;弓形虫基因型Chinese 1不同毒力的分离株诱导巨噬细胞偏移应答的研究[D];安徽医科大学;2013年

  本文关键词：弓形虫新毒力基因TgMAPK1表达特性及其初步功能研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：258363