嗜水气单胞菌诱导的草鱼肠道炎症机制研究

发布时间：2017-03-22 05:03

  本文关键词：嗜水气单胞菌诱导的草鱼肠道炎症机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：一、嗜水气单胞菌诱导的草鱼肠道炎症实验模型的构建目的:嗜水气单胞菌是引起养殖鱼类肠道炎症的主要条件致病菌,其致病机理很大程度上仍不清楚。本研究旨在构建嗜水气单胞菌诱导的草鱼肠道炎症模型,为加深了解细菌性肠道炎症的致病机理提供可重复的实验模型。方法:以不同浓度的嗜水气单胞菌菌液经肛门灌肠感染草鱼,根据炎性症状的疾病活动指数筛选出诱导肠道炎症的适宜剂量。以肛门灌注2.7′106 CFU/尾嗜水气单胞菌诱导产生肠道炎症,采用光学显微镜和扫描电镜观察细菌感染后肠道的病理变化,测定整个实验观察期内的肠道组织髓过氧物酶活性,分析促炎细胞因子IL-1b、IL-8和肿瘤坏死因子a(TNF-a)的表达水平的变化。结果:组织病理学检查显示,嗜水气单胞菌感染后第3天,出现肠道绒毛粘连和脱落等严重的肠道损伤,并伴随严重的炎性细胞浸润。超微结构观察也显示,细菌感染引起微绒毛脱落。在随后18天的实验期内,受损的程度绒毛逐渐修复。结果还显示,嗜水气单胞菌感染诱导的炎性应答反应与促炎细胞因子IL-1b、IL-8和TNF-a的表达以及髓过氧物酶的活性密切相关,处理后的第3天,肠道内这些细胞因子的m RNA表达和MPO活性达到最高水平。结论:嗜水气单胞菌引起的肠道损伤以及随后的修复与炎症相关基因或生物标志随时间的变化是完全一致的。因而,我们已成功构建了高密度养殖鱼类肠道炎症的实验模型。该模型可望用于揭示草鱼和其他养殖鱼类细菌性肠炎的致病机制,筛选具潜在应用价值的水产养殖抗菌药物。二、嗜水气单胞菌诱导的草鱼肠炎的肠道转录组比较研究目的:草鱼是一种非模式动物,其基因组信息有限,导致人们对草鱼的分子免疫途径、物质代谢模式及发育机制的了解相对缺乏。本研究旨在利用转录组测序策略揭示肠道组织的基因表达及嗜水气单胞菌诱导后肠道基因表达模式的变化,从而探讨嗜水气单胞菌诱导草鱼肠道炎症的分子机制。方法:分别提取健康草鱼的胸腺、头肾、脾脏、肝脏、表皮、鳃、肠道等组织的总RNA,检测合格后等量混合,构建c DNA文库,利用第二代高通量测序技术进行转录组从头测序。采用嗜水气单胞菌感染草鱼,从感染1 d后具明显炎症症状的草鱼肠道组织中提取总RNA,并以健康鱼肠道组织的总RNA为对照,测定肠道转录组,比较分析细菌诱导后肠道内基因的表达变化。通过GO和KEGG分析,探讨差异表达基因的功能。此外,分别从诱导前以及细菌感染1 d与3 d后的肠道组织提取总RNA,通过q PCR方法检测转录组测序筛选的肠道炎症通路中差异表达基因的时序表达,进而分析炎症相关基因与嗜水气单胞菌诱导的草鱼肠道炎症的关联性。结果:高通量测序共获得45,867,282个总clean reads,装配成120,964个contigs和67,413个unigenes。COG成功注释了23,275个unigenes,分别隶属于25个特定类群。通过GO功能注释,鉴定出26,567个转录本,归于53个功能群,分别属于生物过程、细胞成分与分子功能3个类别。有28,386个unigenes被映射到259个KEGG通路。转录组比较显示,健康对照组和嗜水气单胞菌感染组的肠道中,共表达基因达到18,170个,差异表达的基因达549个,其中,315个上调表达,234个下调表达。按照功能类别,差异表达基因中有36.43%的基因与细胞成份相关,38.25%与基因的分子功能相关,38.99%与参与的生物过程相关。差异基因共涉及到165条通路,主要包括类风湿关节炎、抗原加工和递呈、吞噬体、氧化磷酸化、I型糖尿病、溶酶体、核糖体通路、细胞因子及其受体的相互作用等免疫相关通路。q PCR分析结果显示,嗜水气单胞菌感染后,不同的炎症相关细胞因子在肠道组织中的表达变化存在差异。IL-10、IL-10Ra、IL-10Rb、IL-2RG、IL-17R、IL-22、IL-23等7个基因在致炎1 d后表达量上调至最高水平;IL-12p40、IL12Rb2基因在第3 d上调至最高。IL-23R、IL-6基因则在致炎后第3 d才显著上调,而IL-21在致炎后第3 d显著下调。结论:嗜水气单胞菌感染引起草鱼肠道组织中细胞成分发生变化,细胞因子活性、氧气转运活性、物质跨膜等分子功能失调,细胞有丝分裂、应答细菌感染、免疫应答、ATP的生物合成等生物过程异常,引起肠道炎症通路相关基因显著上调,最终导致草鱼肠道炎症的发生。三、草鱼IL-23p19基因的克隆及其在肠道炎症中的表达特征分析目的:对草鱼IL-23p19进行克隆和分子鉴定的基础上,揭示该基因在肠道炎症过程中的表达特征及其炎症发生中的可能作用。方法:基于转录组测序获得的IL-23p19部分序列设计特异引物,采用c DNA末端快速克隆(RACE)技术从草鱼肠道组织中克隆IL-23p19的全长c DNA,进而分离其基因组DNA。采用生物信息学分析方法解析该基因的结构、编码产物、分子演化。构建重组表达质粒p EGFP-C1-gc IL-23p19,转染HEK293T细胞,揭示草鱼IL-23p19蛋白的亚细胞定位。采用实时定量PCR技术,测定IL-23p19在健康草鱼组织中的表达谱,分析嗜水气单胞菌感染对该基因表达的影响,以及不同感染方式下肠道组织内随时间的表达差异。结果:利用RACE技术成功克隆了草鱼IL-23p19基因(gc IL-23p19)的全长c DNA序列,其ORF长567 bp,编码188个氨基酸。c DNA和基因组DNA序列比对显示,gc IL-23p19由4个外显子和3个内含子组成,其外显子/内含子构成与鲤科鱼类斑马鱼和哺乳动物小鼠和人类的同源基因相同。基于氨基酸序列构建的系统树显示,gc IL-23p19与同属鲤科的鲤鱼、斑马鱼一致性较高而组成一独立分支,该分支而与其他硬骨鱼类聚为一类,而与由鸟类和哺乳动物组成的另一类平行。激光共聚焦分析显示,IL-23p19蛋白主要定位于HEK293T细胞的细胞质中。实时定量PCR分析结果表明,IL-23p19基因在各种组织中均有表达,但组织间的表达水平存在明显差异。其中,头肾、肌肉、肝脏的表达水平最低,而鳃、血液、表皮和体肾的表达最高。腹腔注射嗜水气单胞菌可显著上调IL-23p19表达水平,上调幅度最大的组织是肠道,其他依次为表皮、血液、肌肉、脾脏、鳃等。结果还显示,腹腔注射与肛灌嗜水气单胞菌两种不同的感染方式对肠道IL-23p19表达的调节上存在差异,肛灌24 h后的IL-23p19表达量约达到健康对照的700倍,而腹腔注射仅为70倍。这意味着gc IL-23p19在系统免疫与局部免疫过程中可能存在不同的促炎作用机制。结论:我们首次从养殖鱼类中克隆和鉴定了IL-23p19基因,其表达特征表明该基因在嗜水气单胞菌诱导的草鱼肠道炎症过程中发挥重要的调节作用。四、草鱼IL-23R基因克隆及其在肠道炎症中的功能分析目的:对草鱼白细胞介素-23受体基因IL-23R进行克隆和分子鉴定的基础上,分析该基因在肠道炎症中的功能。方法:基于转录组测序获得的IL-23R部分序列设计特异引物,采用c DNA末端快速克隆(RACE)技术从草鱼肠道组织中克隆IL-23R基因的全长c DNA。对该基因进行分子鉴定的基础上,筛选出IL-23R抗原区并进行抗原区基因合成,构建原核表达载体p GEX5T-IL-23R的重组质粒,以原核表达产物为抗原免疫小鼠,制备多克隆抗体rgc IL-23R p Ab,并经Western blot鉴定其特异性。利用嗜水气单胞菌诱导的草鱼肠道炎症模型进行IL-23R的免疫组化分析。采用q PCR技术定量检测嗜水气单胞菌刺激前后草鱼各组织中IL-23R两个剪接体的表达水平,分析嗜水气单胞菌刺激对不同剪接体表达的影响,比较腹腔注射和肛灌嗜水气单胞菌两种不同感染方式下IL-23R两个剪接体在肠道组织中的表达水平。结果:利用RACE技术克隆了草鱼IL-23R基因的两个剪接体gc IL-23RX1与gc IL-23RX2的全长c DNA,大小分别为2875 bp和2730 bp,分别编码763和717个氨基酸。生物信息学预测显示,两种剪接体均含长22氨基酸残基的信号肽序列,以及一个跨膜结构域。氨基酸序列比对结果显示,与I型细胞因子受体家族保守的WSXWS基序相比,草鱼中相应部位序列为MSEWS,也不同于斑马鱼的CSMWS。系统树分析显示,草鱼IL-23R基因与斑马鱼基因最为相似,相对地与鸟类、爬行类较为接近,而与哺乳类差异较大。SDS-PAGE分析结果显示,原核表达的gc IL-23R抗原区分子量与预测相吻合。Western blot分析证实了多克隆抗体rgc IL-23R p Ab的特异性。肠道免疫组化结果显示,gc IL-23R在肠上皮细胞以及浸润于粘膜组织的嗜酸性粒细胞和巨噬细胞中表达,这与哺乳类观察到的IL-23R表达于T细胞、单核细胞和树突状细胞相类似。q PCR分析显示,IL-23R基因的两个剪接体在各种草鱼组织中均有表达,但总体上gc IL-23RX1的表达水平高于gc IL-23RX2。腹腔注射嗜水气单胞菌后,各种组织中两种剪接体的表达水平出现了不同程度的变化。结果还显示,肛灌对肠道组织gc IL-23RX1和gc IL-23RX2表达的影响明显大于腹腔注射,而且,gc IL-23RX2的表达水平变化幅度大于gc IL-23RX1。结论:我们首次从养殖鱼类中克隆和鉴定了IL-23R基因的两个转录剪接体。IL-23R在嗜水气单胞菌刺激诱导的草鱼肠道粘膜的局部炎症应答中发挥了重要的作用。但是,两种剪接体在草鱼肠道炎症通路中发挥的功能存在差异。
【关键词】：草鱼 肠道炎症 嗜水气单胞菌 实验模型 草鱼 嗜水气单胞菌 转录组测序 差异表达基因 肠道炎症 草鱼 IL-23p19 亚细胞定位 表达特征 草鱼 IL-23R 剪接体 肠道炎症
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S943
【目录】：

• 中文摘要4-9
• Abstract9-19
• 前言19-25
• 参考文献21-25
• 第一章 实验材料与一般方法25-37
• 1 实验材料25-30
• 1.1 材料25-30
• 2 主要仪器设备30-31
• 3 数据库及软件31-32
• 4 常用的实验方法32-37
• 4.1 主要试验器具的准备32
• 4.2 总RNA的抽提32
• 4.3 DNA的抽提32-33
• 4.4 琼脂糖凝胶电泳33
• 4.5 SDS-PAGE蛋白质电泳33
• 4.6 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备与重组DNA的转化33-34
• 4.7 石蜡切片的取材与制作34-35
• 4.8 电镜样品的取材与制作35-36
• 4.9 实时定量PCR (qPCR)36-37
• 第二章 嗜水气单胞菌诱导的草鱼肠道炎症模型的构建37-53
• 引言37
• 1 材料与方法37-41
• 1.1 材料37-38
• 1.2 方法38-41
• 2 结果与分析41-48
• 2.1. 嗜水气单胞菌诱导的草鱼肠道炎症模型41-43
• 2.2 嗜水气单胞菌诱导的肠道组织变化43-45
• 2.3 肠道上皮细胞表面的超微结构变化45-46
• 2.4 肠道MPO活性变化46-47
• 2.5 嗜水气单胞菌攻毒处理引起的肠道内促炎细胞因子IL-1b、IL-8 和TNF-a的上调表达47-48
• 3 讨论48-50
• 参考文献50-53
• 第三章 嗜水气单胞菌诱导草鱼肠炎的肠道转录组比较研究53-82
• 引言53-54
• 1 材料与方法54-60
• 1.1 材料54
• 1.2 方法54-60
• 2 结果与分析60-76
• 2.1 RNA提取与质量检测60-61
• 2.2 草鱼RNA-seq分析和de novo组装61-62
• 2.3 预测蛋白质注释62-63
• 2.4 Unigene功能注释63-64
• 2.5 GO功能注释64-65
• 2.6 Unigene代谢通路分析65-67
• 2.7 鉴定和注释差异表达基因67-68
• 2.8 差异基因的GO分析68-73
• 2.9 差异基因的Pathway分析73-75
• 2.10 差异表达基因的qPCR验证75-76
• 2.11 肠道炎症通路中相关基因在嗜水气单胞菌诱导的草鱼肠道中的表达变化..5776
• 3 讨论76-78
• 参考文献78-82
• 第四章 草鱼IL-23P19 基因的克隆及其在肠道炎症中的表达特征分析82-108
• 引言82
• 1 材料和方法82-91
• 1.1 材料82
• 1.2 方法82-91
• 2 结果与分析91-103
• 2.1 IL-23p19 全长cDNA的克隆91-98
• 2.2 gcIL-23p19 基因组序列及其结构98-100
• 2.3 gcIL-23p19 的亚细胞定位100-101
• 2.4 gcIL-23p19 基因的表达谱101
• 2.5 嗜水气单胞菌感染对草鱼组织gcIL-23p19 基因表达的影响101-102
• 2.6 嗜水气单胞菌不同方式感染后gcIL-23p19 在草鱼肠道中的表达差异102-103
• 3 讨论103-106
• 参考文献106-108
• 第五章 草鱼IL-23R基因克隆及其在肠道炎症中的功能分析108-142
• 引言108-109
• 1 材料与方法109-117
• 1.1 材料109
• 1.2 方法109-117
• 2 结果与分析117-137
• 2.1 gcIL-23R基因的克隆及其生物信息学分析117-130
• 2.2 gcIL-23R基因的原核表达与多克隆抗体制备130-132
• 2.3 gcIL-23R基因的表达谱分析132-133
• 2.4 嗜水气单胞菌诱导对各组织gcIL-23R表达的影响133-134
• 2.5 嗜水气单胞菌不同感染方式对gcIL-23R在肠道诱导表达的影响134-135
• 2.6 gcIL-23R在嗜水气单胞菌诱导的草鱼肠道炎症模型中的作用135-137
• 3 讨论137-139
• 参考文献139-142
• 第六章 总结与思考142-144
• 1 本研究的结论和意义142-143
• 2 本研究的不足之处143-144
• 文献综述144-182
• 1 硬骨鱼类肠道粘膜免疫与肠道炎症的研究进展144-154
• 1.1 硬骨鱼类肠道粘膜免疫144-150
• 1.2 鱼类的肠道炎症150-151
• 1.3 炎症因子在鱼类肠道炎症中的作用151-152
• 1.4 鱼类肠炎模型152-154
• 2 IL-23 和IL-23R的研究进展154-163
• 2.1 IL-23 和IL-23R的发现与分子结构154-156
• 2.2 IL-23 的分泌及作用机理156-157
• 2.3 IL-23R与信号传导157-159
• 2.4 IL-23 与疾病的关系159-163
• 2.5 IL-23 作为治疗炎症性疾病靶点的应用前景163
• 参考文献163-182
• 攻读博士学位期间公开发表的论文182-183
• 本研究资助项目183-184
• 中英文缩略词汇表184-186
• 致谢186-187

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前9条

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