碳纳米管载药系统构建及其对草鱼出血病防控研究

发布时间：2017-03-22 13:14

  本文关键词：碳纳米管载药系统构建及其对草鱼出血病防控研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：草鱼出血病是由草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV)引起的严重危害当年草鱼鱼种的传染性疾病。无特定病原携带苗(Specific Pathogen Free,SPF)生产和疫苗免疫是对其进行防控的最有效措施。SPF因生产成本高和生产周期长等影响,制约了该项技术的发展;注射免疫受鱼种规格和操作技术等限制,也难以在渔业生产中大规模推广应用。纳米载药系统具有载药率高和极易穿透组织屏障实现药物高效转运等优点,已成为医学领域研究的热点。本研究以单壁碳纳米管(SWCNTs)为材料,采用化学修饰和分子生物学技术制备碳纳米管载药、亚单位和核酸疫苗系统;通过草鱼SPF苗种制备和浸浴免疫技术研究,评价其对草鱼出血病的防控效果;深入探索碳纳米管对鱼类细胞的跨膜和代谢作用机制,评估其对鱼类早期发育毒性。取得结果如下:1.草鱼无特定病原携带苗种研究通过抗病毒药物(三氮唑核苷和吗啉胍)的酯化修饰和碳纳米管酸化修饰,分别将抗病毒药物与碳纳米管化学连接,制备碳纳米管载三氮唑核苷(R-SWCNTs)和吗啉胍药物系统(M-SWCNTs)。高效液相色谱检测R-SWCNTs和M-SWCNTs中药物含量分别为20.45±0.36%和32.41±0.24%。通过GCRV病毒人工感染草鱼仔鱼和鱼种,并经R-SWCNTs和M-SWCNTs药浴检测其抗GCRV病毒效果,结果显示:当R-SWCNTs和M-SWCNTs处理组中药物浓度达到10 mg/L时,染毒仔鱼和鱼种存活率均达90%以上,病毒感染率降为0;而纯药物(三氮唑核苷和吗啉胍)处理浓度为20 mg/L时,染毒草鱼仔鱼和鱼种存活率仍低于35%,病毒感染率约为50%。草鱼仔鱼和鱼种药物代谢研究表明:碳纳米管载药与纯药物处理相比,药物在仔鱼体内含量提高约5倍,代谢时间延长约6倍;药物在鱼种体内含量提高约3倍,代谢时间延长约2倍。2.碳纳米管载亚单位疫苗免疫效果研究通过原核重组技术构建GCRV病毒外膜蛋白原核表达质粒(p ET32a-vp7)和菌株。经发酵和纯化技术制备重组VP7亚单位疫苗(47.8 KDa),并与酰基化碳纳米管连接制备SWCNTs-VP7亚单位疫苗系统,蛋白检测其疫苗承载率为48.9%。通过SWCNTs-VP7分别浸浴和注射免疫草鱼(0.2 g和25 g),结果显示:SWCNTs-VP7可显著增强血清抗体效价(P0.05)、延长抗体保留时间,提高呼吸爆发、溶菌酶、补体等活性和免疫相关基因(Ig M、Ig D和MHC-I等)表达(P0.05);免疫21 d攻毒后,两种规格草鱼在20 mg/L SWCNTs-VP7浸浴免疫的保护率均高达90%以上,与两种规格草鱼分别注射1.0μg/尾和100.0μg/尾的免疫保护率相似;而20 mg/L VP7浸浴免疫的保护率低于25%,两种规格草鱼分别注射1.0μg/尾和100.0μg/尾的保护率低于40%。由此可见,SWCNTs可提高亚单位疫苗免疫保护率,通过浸浴免疫达到注射免疫保护效果。3.碳纳米管载核酸疫苗免疫效果研究采用真核重组技术制备GCRV核酸疫苗(pc DNA-vp7),并经静电吸附作用与氨基化修饰碳纳米管进行连接,制备碳纳米管载核酸疫苗系统(SWCNTs-pc DNA-vp7)。将SWCNTs-pc DNA-vp7经注射和浸浴免疫草鱼(25 g),结果显示:SWCNTs-pc DNA-vp7可显著增强免疫抗体效价(P0.05),延长抗体保留时间,显著提高呼吸爆发、补体、超氧化物歧化酶等活性和免疫相关基因(Ig M、CD8α和MHC-IIB等)表达(P0.05);免疫28 d攻毒后,SWCNTs-pc DNA-vp7浸浴免疫(10 mg/L)的保护率达100%,与注射5μg/尾免疫保护率相似;而pc DNA-vp7在相同免疫剂量下保护率低于30%。因此,碳纳米管能降低核酸疫苗用量,通过浸浴免疫达到注射免疫保护效果。4.碳纳米管细胞跨膜及代谢作用研究通过荧光显像技术和流式细胞术分析荧光标记碳纳米管(F-SWCNTs)在鲤上皮瘤细胞(EPC)中的跨膜机制,结果发现:碳纳米管通过能量消耗和直接穿透两种方式共同实现细胞跨膜作用。其中前者是以网格蛋白介导的胞吞和巨胞饮来发挥主要作用,而囊膜介导的胞吞作用影响较小。采用荧光显像和拉曼光谱技术分析SWCNTs在EPC细胞中的代谢和降解过程,结果表明:SWCNTs(100 mg/L)可在0.5 h内进入细胞,2 h后含量达到24.71×10-6 pg/细胞,去除SWCNTs并每6 h更新一次培养基至48 h后,SWCNTs胞内含量降为0.47×10-6 pg/细胞;同时胞内SWCNTs的拉曼光谱D峰与G峰比值由初始的0.18上升至0.91,透射电镜观察发现SWCNTs大量出现在细胞类溶酶体结构中。上述结果说明SWCNTs可在鱼类细胞内降解和代谢,其降解与胞内类溶酶体结构有关。5.碳纳米管对鱼类安全性评价SWCNTs对稀有泩鲫早期发育急性毒性研究发现:SWCNTs对仔鱼的144 h半数致死浓度(LC50)和半数畸形浓度(EC50)分别为140.8(109.3-174.2)和109.8(85.1-135.1)mg/L。当SWCNTs浓度在100 mg/L时,可降低仔鱼体长和心率、加快仔鱼游动速度;显著降低谷胱甘肽含量和过氧化氢酶活性(P0.05);显著提高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽S-转移酶、活性氧、Caspase-3、8和9活性(P0.05);显著增加丙二醛含量和DNA损伤(P0.05);导致hsp70、apaf-1、bcl-2、caspase-3和9基因表达显著上调(P0.05)。荧光标记F-SWCNTs浸浴仔鱼代谢结果表明:F-SWCNTs可迅速进入仔鱼体内,但去除F-SWCNTs并代谢至144 h时仔鱼体内荧光信号消失,透射电镜观察未发现组织中有SWCNTs。上述结果说明:SWCNTs对鱼类毒性较低,并易被代谢排出体外。综上所述:碳纳米管载抗病毒药物能通过药浴阻断草鱼体内病毒传播,获得无特定病原携带苗种;碳纳米管载基因工程疫苗能通过浸浴免疫达到注射免疫效果,实现草鱼有效免疫保护。同时,碳纳米管对鱼类毒性较低,对水产动物无特定病原携带苗种生产和基因工程免注射疫苗开发具有广阔的应用前景。
【关键词】：草鱼出血病 碳纳米管载药系统 无特定病原携带苗 跨膜机制 安全性
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S943
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-14
• 第一章 文献综述14-24
• 1.1 草鱼出血病研究历史14
• 1.2 草鱼出血病流行病学研究14
• 1.3 草鱼呼肠孤病毒生物学研究14-16
• 1.3.1 草鱼呼肠孤病毒形态特征14-15
• 1.3.2 草鱼呼肠孤病毒理化特性15
• 1.3.3 草鱼呼肠孤病毒细胞培养和感染特征15
• 1.3.4 草鱼呼肠孤病毒分子生物学特征15
• 1.3.5 草鱼呼肠孤病毒转录和翻译15-16
• 1.4 草鱼呼肠孤病毒检测16
• 1.5 草鱼出血病防控技术研究进展16-17
• 1.5.1 草鱼出血病药物防控16
• 1.5.2 草鱼出血病疫苗预防16-17
• 1.5.3 疫苗免疫途径研究17
• 1.6 碳纳米管纳米载体研究17-20
• 1.6.1 碳纳米管作为药物载体研究18
• 1.6.2 碳纳米管作为多肽和蛋白质载体研究18-19
• 1.6.3 碳纳米管作为基因载体研究19-20
• 1.7 碳纳米管跨膜转运20-21
• 1.7.1 直接穿透细胞膜20
• 1.7.2 能量介导的内吞作用20
• 1.7.3 不依赖能量的非内吞作用机制20-21
• 1.7.4 穿过脂双层的扩散作用21
• 1.8 碳纳米管毒性研究21-23
• 1.8.1 碳纳米管细胞毒性21
• 1.8.2 碳纳米管动物毒性21-23
• 1.9 选题的目的和意义23-24
• 第二章 草鱼无特定病原携带苗种研究24-48
• 2.1 材料与方法25-30
• 2.1.1 碳纳米管样品25
• 2.1.2 碳纳米管结构修饰25-26
• 2.1.3 抗病毒药物修饰26
• 2.1.4 碳纳米管载药系统构建26
• 2.1.5 碳纳米管载药系统合成效果检测26-27
• 2.1.6 实验病毒与动物27
• 2.1.7 病毒感染与抗病毒评价27-29
• 2.1.8 药物代谢动力学29-30
• 2.2 实验结果与分析30-46
• 2.2.1 碳纳米管载药系统合成效果检测30-34
• 2.2.2 碳纳米管载三氮唑核苷系统抗病毒效果评价34-37
• 2.2.3 碳纳米管载吗啉胍系统抗病毒效果评价37-41
• 2.2.4 碳纳米管载药系统在草鱼仔鱼体内药物代谢动力学41-42
• 2.2.5 碳纳米管载药系统在草鱼鱼种体内药物代谢动力学42-46
• 2.3 讨论46-47
• 2.4 小结47-48
• 第三章 碳纳米管载亚单位疫苗免疫效果研究48-68
• 3.1 材料与方法49-53
• 3.1.1 实验病毒与动物49
• 3.1.2 VP7目的基因扩增49
• 3.1.3 VP7蛋白原核表达菌株构建49
• 3.1.4 VP7蛋白诱导表达49-50
• 3.1.5 VP7蛋白制备50
• 3.1.6 碳纳米管载VP7亚单位疫苗系统构建50
• 3.1.7 碳纳米管载VP7亚单位疫苗系统合成效果检测50-51
• 3.1.8 草鱼VP7亚单位疫苗免疫51
• 3.1.9 免疫抗体效价测定51-52
• 3.1.10免疫相关生理指标测定52
• 3.1.11免疫相关基因表达测定52-53
• 3.1.12免疫草鱼病毒攻毒实验53
• 3.2 实验结果与分析53-67
• 3.2.1 重组VP7蛋白表达53-54
• 3.2.2 碳纳米管载VP7亚单位疫苗系统合成效果检测54-56
• 3.2.3 免疫草鱼抗体效价测定56
• 3.2.4 免疫相关生理指标测定56-63
• 3.2.5 免疫相关基因表达测定63-65
• 3.2.6 免疫保护效果65-67
• 3.3 讨论67
• 3.4 小结67-68
• 第四章 碳纳米管载核酸疫苗免疫效果研究68-84
• 4.1 材料与方法68-71
• 4.1.1 实验病毒与动物68
• 4.1.2 VP7目的基因扩增68-69
• 4.1.3 重组真核表达质粒构建69
• 4.1.4 核酸疫苗制备69
• 4.1.5 碳纳米管载核酸疫苗系统构建69
• 4.1.6 草鱼核酸疫苗免疫69-70
• 4.1.7 重组质粒检测70
• 4.1.8 重组质粒表达检测70
• 4.1.9 免疫草鱼抗体效价测定70
• 4.1.10免疫相关生理指标测定70
• 4.1.11免疫相关基因表达测定70-71
• 4.1.12免疫草鱼病毒攻毒实验71
• 4.2 实验结果与分析71-83
• 4.2.1 重组质粒构建71-72
• 4.2.2 肌肉组织中重组质粒检测72-74
• 4.2.3 肌肉组织中重组质粒表达检测74
• 4.2.4 免疫草鱼抗体效价测定74-76
• 4.2.5 免疫相关生理指标测定76-78
• 4.2.6 免疫相关基因表达测定78-81
• 4.2.7 免疫保护效果81-83
• 4.3 讨论83
• 4.4 小结83-84
• 第五章 碳纳米管细胞跨膜及代谢作用研究84-104
• 5.1 材料与方法85-88
• 5.1.1 细胞培养85
• 5.1.2 碳纳米管荧光标记85
• 5.1.3 碳纳米管细胞跨膜流式细胞仪分析85-86
• 5.1.4 碳纳米管细胞跨膜荧光分析86-87
• 5.1.5 碳纳米管细胞代谢分析87-88
• 5.2 实验结果与分析88-102
• 5.2.1 碳纳米管细胞跨膜流式细胞仪分析88-90
• 5.2.2 碳纳米管细胞跨膜荧光分析90-95
• 5.2.3 碳纳米管细胞代谢荧光观察95-98
• 5.2.4 碳纳米管细胞代谢拉曼光谱检测98-101
• 5.2.5 碳纳米管细胞代谢电镜观察101-102
• 5.3 讨论102-103
• 5.4 小结103-104
• 第六章 碳纳米管对鱼类安全性评价104-122
• 6.1 材料与方法104-108
• 6.1.1 实验动物104-105
• 6.1.2 稀有泩鲫人工催产授精105
• 6.1.3 碳纳米管修饰105
• 6.1.4 碳纳米管结构分析105
• 6.1.5 稀有泩鲫发育毒性评价105-106
• 6.1.6 形态与行为学分析106
• 6.1.7 生理活性指标测定106-107
• 6.1.8 DNA损伤107
• 6.1.9 基因表达分析107-108
• 6.1.10碳纳米管仔鱼体内代谢108
• 6.2 实验结果与分析108-119
• 6.2.1 碳纳米管结构分析108-110
• 6.2.2 毒性观测110
• 6.2.3 仔鱼形态学分析110-111
• 6.2.4 生理指标测定111-115
• 6.2.5 相关基因表达变化115-116
• 6.2.6 碳纳米管仔鱼体内代谢116-119
• 6.3 讨论119-120
• 6.4 小结120-122
• 结论122-123
• 参考文献123-137
• 附录137-139
• 致谢139-140
• 作者简介140-142

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 曾令兵;贺路;;草鱼出血病病毒854株的纯化及其理化特性[J];淡水渔业;1992年02期

2 曾令兵,袁明雄;草鱼出血病病毒高滴度培养方法的研究[J];淡水渔业;2000年04期

3 郭金学;辛雪琼;诸颖;李文新;;功能化多壁碳纳米管对四膜虫的生物效应研究[J];辐射研究与辐射工艺学报;2007年06期

4 刘h-;冯祖强;;注射土法免疫组织浆防治草鱼鱼种出血病[J];淡水渔业;1977年12期

5 刘信勇;朱琳;黄碧捷;张阳;;多壁碳纳米管对斑马鱼体组织内酶活性的影响[J];环境科学研究;2009年07期

6 徐诗英;李婧慧;邹勇;刘林;贡成良;曹广力;薛仁宇;陈辉;;草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP7重组疫苗的构建及其免疫效力评价[J];湖南农业大学学报(自然科学版);2011年06期

7 陈燕q，

本文编号：261597