对虾抗脂多糖因子ALF的功能分析和开发利用

发布时间：2020-06-01 08:42

【摘要】：对虾是重要的水产养殖品种之一,由于各类病害的爆发,对对虾养殖产业造成了巨大的经济损失。对虾抵御病原入侵的主要方式是启动先天免疫应答系统,通过产生免疫效应分子,来清除各种病原。抗菌肽作为对虾免疫应答反应产生的一类重要的效应分子,在清除感染的外来病原的过程中起着重要作用。抗脂多糖因子(Anti-lipopolysaccharride factor,ALF)作为对虾的一类重要的抗菌肽,在先天性免疫系统中起着重要作用。前期的研究表明,在中国对虾体内存在7种不同的ALF基因,其抗菌和抗WSSV活性存在着明显差别,但是对于不同ALF的结构与功能的关系,以及抑菌和抗病毒的作用机理了解较少,亟待深入研究。另外,由于传统抗生素导致的细菌耐药性的问题日益引起大家的关注,寻找新型抗菌活性物质来替代传统抗生素的需求更加迫切。抗菌肽由于其抗菌机理与传统抗生素存在明显差别,不会引起细菌耐药性的问题,被认为是抗生素的理想替代物。本论文为解决未来可能的应用问题,通过对ALF的结构进行改造,以提高ALF的抗菌活性;同时也通过利用合成生物学,原核和真核重组表达等方法,获得了具有较高生物学活性的抗菌肽重组蛋白。本研究为抗菌肽产品的研发,实现其在医药或水产养殖中的应用奠定了重要基础。主要研究进展如下:1.通过分析中国对虾7种不同ALF的脂多糖结合结构域(LPS binding domain,LBD)短肽的理化特征和功能活性的关系,推测LBD短肽中碱性氨基酸的数量以及亲水和疏水氨基酸的空间排布共同决定着LBD短肽的抑菌活性。为证实此推断,按照以上原则设计合成了一系列短肽,并对其最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)进行了检测,结果表明,有些结构改造后的短肽杀菌能力明显提高,在2-4μM的浓度下即可杀灭大肠杆菌,溶藻弧菌和哈维氏弧菌等,且对大部分革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都具有一定的抑制效果。对这些改造后的LBD短肽的生物学活性和杀菌机理进一步分析,结果表明,这些短肽具有很好的热稳定性,即使经过了热处理仍能在短时间内杀灭细菌,其活性未发生明显改变。通过对LBD短肽处理过的细菌进行观察,发现LBD短肽是通过破坏细菌的细胞外膜,导致胞质外溢而杀灭细菌的。圆二相色谱分析的结果表明,LBD短肽呈典型的β-sheet结构。以上研究结果为高活性抗菌肽的设计和改造提供了重要依据。2.针对中国对虾7种ALFs中的一种类型—Fc ALF5,其对大肠杆菌无抑制活性,而对WSSV有抑制活性的特点,利用原核重组表达系统成功获得了具有明显抗WSSV活性的重组蛋白,并进一步探讨了其抗WSSV的作用机理。以重组的Fc ALF5为诱饵蛋白,利用Far Western Blot获得了与其存在相互作用的WSSV蛋白,经过LC-MS/MS分析鉴定,发现该蛋白与WSSV的囊膜蛋白VP24具有最高的相似性。进一步利用原核重组表达获得了VP24重组蛋白,利用点杂交和Far Western Blot验证了Fc ALF5与WSSV的VP24存在相互作用,同时利用FcALF5的LBD短肽也证实了其与VP24的相互作用。由于VP24是WSSV入侵细胞的一种重要的囊膜蛋白,因此推断Fc ALF5发挥抗WSSV作用主要是通过LBD结构域和VP24的相互作用来实现的。3.对FcALF2的LBD进行结构改造,抗菌活性明显提高的一种类型(LBDv),替换对虾Fc ALF2基因原有的结构功能域,并结合酵母系统密码子的偏好性,利用生物合成的方法合成该基因,并对该基因在宿主菌毕赤酵母GS115进行重组表达,成功获得了目的蛋白。对重组表达获得的蛋白进行抗菌活性分析,结果表明,该蛋白具有明显的抗菌和抗WSSV活性。此系统的建立为利用体外真核表达系统获得重组蛋白并在生产上应用奠定了重要基础,也为抗菌肽药物的开发和利用提供了重要参考。
【图文】：

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第一章文献综述1.1 前言对虾属于节肢动物门，甲壳动物亚门，是水产养殖的重要养殖品种，给水产业带来了巨大的经济效益。对虾的蛋白质含量高，脂肪含量低，且含有多种维生素及微量元素，是优质水产品的代表之一，并深受人们喜爱。随着生活水平的提升，对虾需求量的日益增长，世界对虾市场依然呈现供不应求的局面。因此对虾的人工养殖，在最近二十年间，有了突飞猛进的增长。根据联合国粮农组织 FAO统计，全球对虾产量（包括人工养殖量和捕捞量）由 1970 年的 9000 吨左右，发展到 2006 年的 315 万吨。最近几年，全球对虾的产量也保持在 350 万吨以上，具体统计数据见于图 1.1 所示。随着我国对虾产量的逐年上升，在赶超泰国后，已经成为对虾养殖的第一大国。

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(Tsai et al., 1999)。该病主要是由对虾白斑综合症病毒（white spot syndrome virus，WSSV）引起(Kanchanaphum et al., 1998)。WSSV 是一种含有囊膜的 DNA 病毒，，该病毒感染对虾后，能够造成对虾在短时间内大量死亡，给对虾养殖带来致命性的灾难。虽然大量的研究尝试着解决这一难题，但是目前仍没有有效的方法，主要以预防为主(Liu et al., 2009; Robalino et al., 2007)。此外还有黄头病毒（yellowhead virus，YHV）导致的对虾黄头病（YHD）(Brown et al., 2012)，偷死病毒（covertmortality nodavirus，CMNV）引起的偷死病（CMD）(Zhang et al., 2014)，小孢虫寄生虫（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）引起的肝胰腺微孢子虫病（HPM）(Chayaburakul et al., 2004; Tourtip et al., 2009)，林查辛格病毒（Laem Singh virus，LSNV）导致的斑节对虾慢大症（Monodon slow growth syndrome，MSGS）(Pratoomthai et al., 2008)等。总之，各种虾类病原体的出现，给对虾养殖产业的发展带来了巨大的经济损失。因此为了有效地降低对虾病害的爆发，减少病害所带来的损失，需要对对虾的免疫系统和抗病机理进行系统的研究。
【学位授予单位】：中国科学院研究生院(海洋研究所)
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4

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