粪类圆线虫RIOK-1蛋白激酶基因的结构和功能研究

发布时间：2020-06-30 00:41

【摘要】：寄生线虫给畜牧业带来重大经济损失并且严重危害人类健康,全球至少有1亿人口感染了寄生线虫。在畜牧业上仅仅捻转血矛线虫,就造成了全球性的数以百万的羊感染,并且每年造成近乎100亿美元的经济损失。目前控制寄生线虫感染的方法仅限于化学药物,并且过分的依赖于早期研发的数量有限的几种药物。由于大量,长期的使用药物,已经诱导寄生线虫抗药性的产生。由于寄生线虫生活史复杂,宿主多样并且具有逃避宿主免疫的机制,使疫苗和抗寄生虫药物研发十分缓慢。新型药物以及疫苗的研发需要对寄生虫发育过程中必需基因的功能进行深入研究。因此本研究选取了近年来报道的一类非典型蛋白激酶RIO蛋白激酶家族成员之一,RIOK-1为研究对象,以具有体外生活周期的人畜共患寄生线虫粪类圆线虫(Strongyloides stercoralis)为寄生线虫模型,利用分子生物学方法和生物信息学的方法分离了粪类圆线虫RIOK-1激酶编码基因Ss-riok-1的c DNA及g DNA序列;分析了该激酶编码基因在粪类圆线虫不同发育阶段的转录水平及其重组蛋白Ss-RIOK-1的体外激酶活性;利用转基因的方法分析了Ss-riok-1在幼虫体内的组织学定位以及该激酶在粪类圆线虫幼虫发育阶段的重要功能。(1)粪类圆线虫RIOK-1编码基因的结构特征Ss-riok-1的c DNA全长为2056 bp,包括CDS 1524 bp,编码507个氨基酸,5’UTR377 bp,3’UTR 155 bp。Ss-riok-1的全长基因组序列包括5’UTR,3’UTR和编码区一共为6117 bp,其编码区含有两个内含子,长度分别为134 bp和64 bp。在Ss-riok-15’UTR内也含有两个内含子,大小分别为711 bp和3148 bp。Ss-riok-1的启动子长度为4280 bp,含有真核生物常见的启动子元件。RIOK-1激酶具有该家族保守的RIO激酶功能域,其功能域包括ATP结合区;可变环;铰链区;催化活性区和金属离子结合区。与RIO区域的保守性不同,RIOK-1的N端和C端在不同物种间相似性较低。Ss-RIOK-1在体外具有自磷酸化和磷酸化丝氨酸/苏氨酸激酶通用底物牛髓磷脂蛋白的活性,并且通过突变掉催化位点的天冬氨酸可以使激酶丧失催化活性。(2)粪类圆线虫RIOK-1激酶编码基因Ss-riok-1的时空表达特征通过Ss-riok-1的转录水平分析,我们发现该基因在粪类圆线虫的所有发育阶段均有转录,且在感染性三期幼虫中转录水平最高。Ss-riok-1在粪类圆线虫幼虫体内细胞的胞质中有明显的表达。其表达部位主要表现在部分皮下细胞以及神经元细胞中,主要包括头部神经元,尾部神经元以及部分躯体运动神经元。Ss-riok-1的表达形式随着幼虫的发育发生了变化,从刚孵化的幼虫的全身性表达到二期幼虫的神经系统表达最终在感染性三期幼虫的肌肉组织中表达。(3)突变的RIOK-1影响粪类圆线虫幼虫的发育突变的RIOK-1激酶同样表达在幼虫体内细胞的胞质中。突变的激酶在虫卵内的表达导致虫卵孵化率的下降及该寄生线虫后自由生活阶段二期幼虫的运动性的降低,并且造成了从后自由生活阶段二期幼虫到感染性三期幼虫发育的缺陷,表现为幼虫蜕皮的不完全和咽部结构的不完全发育。(4)Ss-RIOK-1潜在的互作蛋白的初步验证根据秀丽新杆线虫基因互作的数据库的预测和分析,初步选择了五个可能与Ss-RIOK-1相互作用的蛋白编码基因Ss-lin-35、Ss-riok-2、Ss-kin-3、Ss-nob1和Ss-pno1。但是通过酵母双杂交系统的验证证明以上基因编码的蛋白均不与Ss-RIOK-1发生直接的相互作用。本研究首次在寄生线虫中研究了Qg源的RIOK-1蛋白激酶的功能,使我们对RIOK-1激酶在寄生线虫生长发育调控中发挥的作用有了更深的认识,为进一步评估RIOK-1作为可能的药物靶点奠定了基础。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.7
【图文】：

氨基酸序列,天冬酰胺,蛋白激酶,真核生物

：Ss-riok-1 的 CDS 的扩n of the coding sequence量标尺；1：Ss-riok-1NA Marker; 1: Ss-riok-1达到了 66.99%。编氨基酸序列 LVHA区，如图 4-2 显示： V），催化活性区（Ss-RIOK-1 还具有 RG-x-[ILV]-S-T-G-K-E真核生物蛋白激酶（和天冬酰胺则非常合 ATP 的赖氨酸也白激酶家族失去了在c and Wlodawer 2004

氨基酸序列,比对分析,同系物,物种

40图 4-2：Ss-RIOK-1 氨基酸序列与来自所选择的物种同系物的比对分析Fig. 4-2: Alignment of Ss-RIOK-1 sequence with its homologues from selected species.图中 α 折叠由灰色标示，下划线标示 β 折叠。亚结构域 I-XI 标注在相应序列的下方。功能区域标注于序列的上方，依次为 ATP 结合区（红色），可变环（黄色），铰链区（黄色），催化活性区（红色），金属离子结合区（黄色）。Gray region shows Alpha-helices, Underline indicate Beta-strand. Subdomains are marked bellow thesequence. Function motif are highlitend and markerd above the sequence, including ATP-binding motif(red), flexible loop (yellow), hinge (yellow), active site (red) and metal binding loop (yellow).

【参考文献】