猪流行性腹泻病毒感染猪小肠上皮细胞抑制IFN-β产生及激活NF-κB机理研究

发布时间：2020-07-03 18:09

【摘要】：猪流行性腹泻病毒(PEDV)是导致猪流行性腹泻(PED)的致病因子,可引发严重腹泻和脱水,诱发高死亡率和发病率,严重影响了世界各国养猪业的发展,并造成了严重的经济损失。虽然该病在其分子流行病学的调查、诊断、预防及治疗方面的研究已有一定的进展,但是该病的爆发仍然呈现逐年递增的趋势。为了有效的控制该病的发生,有必要深入了解PEDV的分子致病机制。其中PEDV与宿主天然免疫系统之间的相互作用的研究可以帮助人们更好的理解PEDV感染和疾病发生的分子机制。PEDV感染后,不能诱导产生I型干扰素(IFN),为PEDV逃避宿主天然免疫反应提供了有利地条件。另外,人们发现病毒感染机体后可以根据自身的特性激活或抑制核转录因子(NF-κB)基因的转录。然而,PEDV感染不能诱导产生I型IFN及是否激活NF-κB的具体机制仍不清楚。PEDV感染机体主要破坏猪肠道上皮组织,引起肠道充血及肠绒毛萎缩,结果导致肠上皮细胞胞浆空泡化,脱落。因此,猪小肠上皮细胞(IECs)是PEDV感染的靶细胞。为了揭示了PEDV逃避天然免疫的机制,本研究选用IECs细胞作为PEDV的感染模型,对PEDV感染IECs后天然免疫反应信号通路进行了较为系统的初步研究。在病毒感染和复制时,宿主的天然免疫应答反应是抵抗其感染的第一道防线,因此,病毒抑制或逃避该免疫应答反应的能力在一定程度上也反应了病毒致病力的强弱。I型干扰素是机体免疫应答的重要产物之一,本研究显示PEDV感染IECs细胞不仅抑制IFN-β的产生,而且还抑制双链RNA(ds RNA)诱导的IFN-β的表达。干扰素调节因子3(IRF-3)和NF-κB是诱导IFN-β发生转录的两个关键因子。我们发现PEDV感染能激活NF-κB,但不能激活IRF-3。此外,PEDV感染能明显抑制ds RNA诱导的IRF-3的核转位及IFN-β的产生。为了阐明PEDV感染抑制IRF-3激活的分子机制,我们研究了IRF-3上游的组成视黄酸诱导基因蛋白(RIG-I)和Toll-样受体3(TLR3)信号通路的信号分子诱导IFN-β的产生。在IRF-3的上游,我们发现TANK结合激酶1(TBK1)或抑制性κB激酶ε(IKKε)介导的IFN-β的产生并不受PEDV感染的影响,但是PEDV感染却完全抑制了RIG-I接头分子线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)及RIG-I介导的IFN-β的产生,说明PEDV感染主要通过干扰RIG-I信号通路中的MAVS的活性而抑制IFN-β的产生。此外,我们还发现PEDV感染只能部分抑制TIR结构域的接头分子l(TRIF)诱导的IFN-β的产生,TRIF是TLR3信号通路的组成部分。综上表明,PEDV感染抑制IFN-β的产生主要是由于阻断了RIG-I信号通路所致。NF-κB调节组成免疫系统的多种因子,包括多种前炎症因子,趋化因子、黏附分子、诱导酶的表达及细胞的增殖。但是过度激活NF-κB将会引起炎症及自身免疫性疾病,因此,人们常将NF-κB的激活也认为是多数疾病感染的标志。本研究中,我们首次报道在PEDV感染IECs细胞能激活NF-κB。在PEDV感染的细胞中,NF-κB激活特征表现在NF-κB从细胞质转移到了细胞核,而且增强了NF-κB调节基因的表达。NF-κB的激活随病毒的感染进程及剂量的增加而增强。紫外灭活的PEDV不能诱导NF-κB的激活。我们在PEDV感染的细胞中检测到IκBα蛋白有降解的趋势,这说明NF-κB的激活可能与IκBα蛋白的降解有关。为了进一步揭示PEDV诱导NF-κB激活的机制,我们研究了NF-κB激活的上游信号通路,视黄酸诱导基因基因I样受体(RLRs)和TLRs信号通路。通过小分子RNA干扰(si RNA)试验,我们的研究结果表明PEDV可能通过TLRs信号通路中的接头分子TRIF和My D88激活NF-κB,而与RLRs相关的RIG-I信号通路无关。我们再次通过对TLRs家族中的TLR2,TLR3,TLR4,TLR8及TLR9基因沉默,发现在PEDV感染的细胞中TLR2,TLR3及TLR9基因沉默后明显抑制了NF-κB调节基因的表达及NF-κB的核易位,而TLR4和TLR8基因沉默并没有影响PEDV诱导NF-κB的激活。已经有研究证实病毒核酸编码的蛋白参与调节NF-κB的激活,因此,我们研究了PEDV编码的结构蛋白在NF-κB激活中的作用。通过NF-κB荧光素酶报告系统对PEDV编码的结构蛋白的筛选,我们发现PEDV核蛋白N能够诱导NF-κB的激活。同时PEDV N蛋白诱导NF-κB的激活具有剂量依赖性。通过激光共聚焦实验,我们检测到在PEDV N蛋白转染的IECs细胞中能促进NF-κB的核易位。此外,通过对N蛋白缺失突变体的研究表明,PEDV N蛋白的中间区域是激活NF-κB所必须的区域。进一步的实验证实,TLR2信号通路参与PEDV N蛋白诱导NF-κB的激活。总之,本文的研究结果为深入了解PEDV的致病的分子致病机制和免疫逃避及PED的综合防治提供了重要的理论依据。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.28
【图文】：

细胞膜,脂肽,支原体,革兰氏阳性菌

主要识别微生物的膜成分，如脂类、脂蛋白和其他一些蛋白(图1-1)。图 1-1 细胞膜表面的 TLRs 识别的病原相关分子模式[12]Fig. 1-1 PAMP recognition by cell surface TLRsTLR2 识别广泛的 PAMPs，如细菌、真菌、寄生虫及病毒的衍生物[3]。这些包括来自细菌的脂肽，来自革兰氏阳性菌的肽聚糖和脂磷壁酸，来自分支杆菌的脂阿拉伯甘露糖，来自真菌的酵母聚糖，来自克氏锥虫的 tGPI-粘蛋白及来自麻疹病毒的血凝素蛋白。TLR2 与TLR1 或 TLR6 通常形成异源二聚体。具体地讲，TLR2-TLR1 异二聚体识别来自革兰氏阴性细菌和支原体三酰基脂肽，而 TLR2-TLR6 异二聚体识别来自革兰氏阳性菌和支原体二酰基脂肽。结构分析表明，这些异二聚体能区分脂蛋白的结构[4, 5]。TLR2-TLR1 和 TLR2-TLR6异二聚体共享一个 M 形结构。在 TLR2-TLR1-配体复合物中，三分之二的 Pam3CSK4 脂质链与 TLR2 交互，而第三链结合 TLR1 的疏水通道。因此

基序,细胞受体,染色质,发病机理

TLR9 缺陷型鼠分析表明，TLR9 是 CpG DNA 的受体[22]。细菌 DNA 中含有去甲基化G 基序，因此具有免疫激活活性。在脊椎动物，CpG 基序的频率被严重减少和 CpG 半胱氨酸残基高度甲基化，导致免疫刺激活性的废除。至少存在两种类型的 CpG DN：A/D 型和 B/K 型。B/K 型 CpG DNA 是传统的、最先被鉴定出来的，并且是炎症因子-12 和 TNF α的诱导剂。A/D 型 CpG-DNA 在结构上不同于传统的 CpG DNA，在 p诱导大量的 IFN-α产生，但不具有诱导 IL-12 的能力。TLR9 能识别这两种类型的 A。事实上在 pDCs 中，TLR9 识别 A/D 型 CpG-DNA 从而刺激细胞产生大量的抗病因子 IFN-α，这说明 TLR9 参与病毒识别。的确 TLR9 除了识别细菌 CpG DNA 外，别病毒衍生的 CpG DNA。而且 TLR9 变异小鼠表现出对鼠巨细胞病毒（MCMV）的23]。在 pDC 细胞或其他类型的 DC 细胞中，MCMV 的 TLR9 依赖性识别通过激活 N释放抗 MCMV 应答。除了细菌和病毒 CpG DNA，TLR9 可能还涉及自身免疫性疾病机理。通过 B 细胞受体对 IgG2a 染色质复合物的一系列处理和 TLR9 通过自身反应胞介导产生有效的类风湿因子[24]。在此模型中，IgG2a 被 B 细胞受体绑定和内化，包括低甲基化的 CpG 基序接合 TLR9，由此诱导类风湿因子。同样地，染色质通过 F内化，然后暴露给 TLR9，TLR9 介导 PDC 细胞通过 IgG 和染色质免疫复合物诱导，这就是系统性红斑狼疮（SLE）的发病机理[25]。因此，TLR9 通过识别染色质结构种自身免疫疾病的发病机理。

【引证文献】