牡丹花衰老相关基因的筛选与功能研究

发布时间：2020-07-07 05:38

【摘要】：牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)是我国的十大名花之首,是美好、幸福、吉祥、富贵的象征,深受世界各国人民的喜爱。牡丹的正常花期在每年4-5月份,尽管现在已通过牡丹春节催花技术实现了人们春节赏花的愿望,但由于牡丹的自然花期比较短,一般仅为7天左右,因此仍不能满足人们赏花的愿望。牡丹的花期长短,直接影响到牡丹的观赏质量和牡丹产区的经济效益。延缓牡丹花衰老,延长牡丹花期对促进旅游业的发展具有积极意义,已成为当前急需解决的重要课题之一。本研究以牡丹‘鲁菏红’为试验材料,通过观察自然条件下牡丹花衰老过程中形态、显微结构的变化,确定了牡丹花的衰老时期。利用抑制性消减杂交技术,构建了牡丹花衰老相关基因的抑制消减杂交文库。通过RACE扩增得到3个牡丹花衰老相关基因的cDNA全长,并对其进行生物信息学分析。构建了pBI121-PsMADS4的超表达载体,利用花序侵染法转化野生型拟南芥,观察PsMADS4转基因拟南芥的表型特征。其主要研究结果如下：1.通过对自然条件下牡丹花衰老过程中花的外形和石蜡组织切片的观察,发现花瓣的组织结构变化趋势和花发育不同时期的形态学变化趋势基本一致,并最终确定牡丹花的衰老时期。2.分别以盛开花瓣和衰老花瓣作为tester (driver)和driver (tester),构建牡丹花衰老相关的正向和反向抑制消减杂交文库,最终分离得到211个有效表达序列标签(EST)序列。根据KEGG数据库的BLAST结果,有48个EST序列得到功能注释。将所得211条EST使用COG数据库进行直系同源聚类分析,发现其中44条EST序列被分成14类：未知功能预测；碳水化合物转运和代谢；蛋白质周转,翻译后修饰和分子伴侣；翻译,核糖体结构和生物转化；脂质转运和代谢；无机离子转运和代谢；细胞骨架；转录；细胞壁和细胞膜的生物合成；胞内运输,分泌和囊泡转运；防御机制；氨基酸转运与代谢；次生代谢物的合成,转运和分解代谢；复制,重组和修复。为进一步分析差异表达基因在不同花衰老时期的表达情况,从211条EST序列中随机选取23条EST进行qRT-PCR分析,结果表明,qRT-PCR结果与花衰老相关的抑制消减杂交结果相一致。3.根据消减文库中获得的长链脂酰辅酶A基因的EST序列设计引物,利用RACE扩增得到2377 bp的PsLACS全长cDNA,其中包含1830 bp的编码区,共编码609个氨基酸,分子量为67.94 KD,等电点为6.191。PsLACS包括30个可能的磷酸化位点,这可能与酶活性的调节有关。二级结构预测显示,PsLACS含α-螺旋和无规则卷曲较多。同源性分析结果表明,PsLACS与葡萄LACS同源性最高,其次是橙子LACS、蓖麻LACS。系统进化树分析结果与同源性比对的结果基本一致。4.质膜内在蛋白作为水通道蛋白的一种存在类型,在跨膜水分运输中起着重要作用。以消减文库中获得的水通道蛋白基因的EST序列为模板设计引物,利用RACE扩增得到1174 bp的PsPIP2全长cDNA,其中包含846 bp的编码区,共编码281个氨基酸,分子量为29.79 KD,理论等电点为9.04。PsPIP2包括8个可能的磷酸化位点,推测这些磷酸化修饰位点可能与PsPIP2蛋白通道的开启与闭合相关。二级结构预测显示,PsPIP2含无规卷曲和a-螺旋较多。同源性分析结果表明,PsPIP2与木薯PIP2同源性最高。5.PsMADS4是从消减文库中分离到的一个在盛花期表达量明显升高的EST。通过RACE-RCR技术扩增获得1081 bp的PsMADS4全长cDNA序列,其中107-844 bp为开放阅读框,总计738 bp,编码245个氨基酸,具有两个保守结构域,其中MADS-box结构域在3-75位氨基酸,K-box结构域在89-176位氨基酸。PsMADS4在拟南芥中的超表达研究表明,转基因拟南芥的开花时间早于野生型,但花期仅略长于野生型拟南芥的花期。
【学位授予单位】：湖南农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S685.11
【图文】：

对牡丹花发育时期外观形态的观察发现，在整个花发育时期，牡丹花的外观形态逡逑发生了明显的变化。牡丹花在ＤＯ时期处于花蕾状态，外层花瓣微微张开，处于初开期逡逑（图２－ｌａ）；邋ＤＯ时期之后的第Ｈ天（Ｄ３），每层花瓣都完全展开，花径达到最大，色泽逡逑亮丽，花型花色得到充分显现，并且散发着香味，此时处于盛开状态（图２－化）；ＤＯ逡逑时期之后的第六天（Ｄ６），花瓣颜色逐渐泛白，并且开始调萎脱落，同时，雄蕊开始脱逡逑落，整朵花开始处于萎嘉的状态（图２－ｌｃ）。通过对牡丹花发育时期外观形态的观察，逡逑我们将牡丹的ＤＯ时期确定初开期，Ｄ３时期确定为盛花期，Ｄ６时期确定为衰老期或谢逡逑花期。在本文Ｗ后的试验中都遵循此处的标准。逡逑图２－１巧丹花不同发育时期的形态变化逡逑ａ：邋ＤＯ时期；ｂ：邋Ｄ３时期；Ｃ：邋Ｄ６时期逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｃｈａｎｇｅｓ邋ｏｆ邋ｔｒｅｅ邋ｐｅｏｎｙ邋ｆｌｏｗｅｒ邋ｉｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ邋ｓｔａｇｅ逡逑ａ：邋ＤＯ邋ｓｔａｇｅ；邋ｂ：邋Ｄ３邋ｓｔａｇｅ；邋ｃ：邋Ｄ６邋ｓｔａｇｅ逡逑２．２巧丹花不同发育时期的组织结构变化逡逑根据对牡丹花发育时期外观形态的观察，选择了邋ＤＯ、Ｄ３和Ｄ６这三个花发育时期逡逑的花瓣，制作石蜡切片，并发现在整个花发育时期，牡丹花瓣的组织结构发生了明显逡逑的变化。在ＤＯ、Ｄ３和Ｄ６时期，花瓣的上表皮细胞和下表皮细胞均非常完整（图２－２）。逡逑但在ＤＯ时期

对牡丹花发育时期外观形态的观察发现，在整个花发育时期，牡丹花的外观形态逡逑发生了明显的变化。牡丹花在ＤＯ时期处于花蕾状态，外层花瓣微微张开，处于初开期逡逑（图２－ｌａ）；邋ＤＯ时期之后的第Ｈ天（Ｄ３），每层花瓣都完全展开，花径达到最大，色泽逡逑亮丽，花型花色得到充分显现，并且散发着香味，此时处于盛开状态（图２－化）；ＤＯ逡逑时期之后的第六天（Ｄ６），花瓣颜色逐渐泛白，并且开始调萎脱落，同时，雄蕊开始脱逡逑落，整朵花开始处于萎嘉的状态（图２－ｌｃ）。通过对牡丹花发育时期外观形态的观察，逡逑我们将牡丹的ＤＯ时期确定初开期，Ｄ３时期确定为盛花期，Ｄ６时期确定为衰老期或谢逡逑花期。在本文Ｗ后的试验中都遵循此处的标准。逡逑图２－１巧丹花不同发育时期的形态变化逡逑ａ：邋ＤＯ时期；ｂ：邋Ｄ３时期；Ｃ：邋Ｄ６时期逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｃｈａｎｇｅｓ邋ｏｆ邋ｔｒｅｅ邋ｐｅｏｎｙ邋ｆｌｏｗｅｒ邋ｉｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ邋ｓｔａｇｅ逡逑ａ：邋ＤＯ邋ｓｔａｇｅ；邋ｂ：邋Ｄ３邋ｓｔａｇｅ；邋ｃ：邋Ｄ６邋ｓｔａｇｅ逡逑２．２巧丹花不同发育时期的组织结构变化逡逑根据对牡丹花发育时期外观形态的观察，选择了邋ＤＯ、Ｄ３和Ｄ６这三个花发育时期逡逑的花瓣，制作石蜡切片，并发现在整个花发育时期，牡丹花瓣的组织结构发生了明显逡逑的变化。在ＤＯ、Ｄ３和Ｄ６时期，花瓣的上表皮细胞和下表皮细胞均非常完整（图２－２）。逡逑但在ＤＯ时期

因为在ｃＤＮＡ合成过程中加入１咕总ＲＮＡ，造成ｃＤＮＡ合成反应体系中总ＲＮＡ逡逑的量大于１００邋ｎｇ，故在接下来的ｃＤＮＡ扩增过程中需将上述ｃＤＮＡ合成产物进行稀释逡逑后再作为扩增模板。图３－２的结果表明，盛开和衰老样品的ｃＤＮＡ扩增产物在开始时逡逑随着扩增循环数的增加而增加，但在进行到２１个循环时达到平台期，之后尽管循环数逡逑增加，其扩增产物也不再增加，并且在高分子量ｃＤＮＡ条带处出现弥散条带，送说明逡逑循环数过多。循环数过多时所得到的ｃＤＮＡ不利于ｃＤＮＡ的消减杂交。由于比达到扩逡逑增平台期少１个循环是最佳循环数，因此确定盛开和衰老样品ｃＤＮＡ的最优循环数均逡逑为２０。对柱层析纯化后的ｄｓ邋ｃＤＮＡ进行电泳检测，发现ｄｓ邋ｃＤＮＡ范围在０．５－１０化（图逡逑３－３）。逡逑４２逡逑

本文编号：2744719