苹果蠹蛾颗粒体病毒对新疆强日照环境的适应性机理及苹果蠹蛾的生物防治

发布时间：2020-07-11 21:32

【摘要】：苹果蠹蛾颗粒体病毒(Cydia pomonella granulovirus,Cp GV)具有对宿主特异性强、致病力高,对非靶标生物安全等特点,在苹果蠹蛾的生物防治中具有重要地位。病毒在环境中易受紫外线辐射失活,而在我国西北强日照干旱环境下可以分离到Cp GV,说明其具有一套适应外界极端环境的机制。对本土苹果蠹蛾颗粒体病毒Cp GV-ZY适应新疆强日照环境机理的研究,不仅能够丰富微生物对极端环境适应机制研究内容,也对进一步筛选在干旱、强光照地区具有强毒力的病毒株系,以及研发针对干旱地区的微生物农药提供基础理论。为了扩繁病毒及为后期实验提供稳定的虫源,进行了苹果蠹蛾的田间采集与室内饲养,并通过与田间种群的比较评价了苹果蠹蛾室内种群的质量。通过对Cp GV颗粒体蛋白基因granulin的克隆和RT-q PCR技术建立了该病毒微量检测方法,并以此对病毒在特异性宿主苹果蠹蛾及非特异性宿主梨小食心虫体内的增殖动态进行了比较。为了验证病毒颗粒体大小与紫外耐受性的关系,进行了室内UVB辐射模型的搭建,并与之和强日照环境下的病毒活性衰减动态做了比较,测试了温度因素对病毒的失活效应;通过电镜技术对不同来源的两株病毒颗粒体进行了形态测量和比较,进一步通过颗粒体裂解实验比较了颗粒体裂解前后病毒对UVB辐射的耐受性差异。通过限制性内切酶酶切分析获得了本土毒株特征性酶切片段。转录组分析获得两株病毒差异表达基因,并进行相对定量进行差异表达基因验证;通过对两株病毒增殖动态及granulin基因相对表达量的比较研究以期获得本土毒株在大颗粒体形成中所用的策略。最后,在该虫的生物防治研究中,探究了两种氧化物对病毒的防紫外保护作用,以及生物源杀虫活性物斑蝥素对该虫的毒力、防效、酶活作用等。主要研究结果结论如下:1.苹果蠹蛾室内种群质量评价及Cp GV在宿主体内增殖动态与田间种群相比,目前室内连续饲养的苹果蠹蛾种群存在幼虫存活率下降、幼虫期延长的情况。但所测的各参数均与其他人工饲养种群情况相符。表明我们的饲养方法虽然能维持该虫的连续饲养,但仍需进一步改进。基于granulin基因的绝对定量PCR,建立了检测范围在104~1011拷贝数/μL的病毒定量检测方法。通过与非特异性宿主梨小食心虫的比较,发现Cp GV在苹果蠹蛾体内复制迅速,在喂毒3d后即进入增殖平台期并引起宿主大量死亡,而病毒对梨小食心虫的LC50和LC90值要分别比苹果蠹蛾高1000倍和73000倍。Cp GV在宿主内增殖动态的研究可为病毒与宿主的互作奠定基础并为本土病毒在今后的开发和应用提供了数据支持。2.Cp GV颗粒体大小与其紫外耐受性关系室内UVB辐射模型表明辐射3.75h可使病毒活性减半,2h 60℃及以上温度或40℃4h及更长时间处理均对病毒活性造成显著影响,而2h的日光辐射环境下使病毒失活的主要因素为紫外线;酸碱溶液对颗粒体的裂解实验表明,弱碱ph9条件下,颗粒体偏大的ZY毒株其裂解程度明显低于M毒株;进一步通过UVB辐射实验,表明单独弱碱处理后病毒活性无明显变化,而增加UVB辐射处理后,两株病毒活性均下降,但只有M毒株活性下降显著(72%);进而表明M毒株紫外耐受性弱于ZY毒株,且随颗粒体的裂解其紫外耐受性下降更明显。从而证实了病毒颗粒体大小与紫外耐受性有关,随着颗粒体的减小其耐受性降低。通过对granulin基因的相对定量实验,结果表明ZY毒株很快进入高表达,但在进入平台期后M毒株表达量增长迅速;两株病毒在增殖动态方面无显著差异,死亡虫体内ZY毒株较M毒株颗粒体产量略高,但差异不显著。该实验表明ZY毒株不是通过减少最终病毒产量而实现颗粒体的增大。3.病毒基因组限制性内切酶图谱分析本土病毒Cp GV-ZY在基因组水平与M毒株存在一定的差异,即在Sal I和Eco RI酶切片段中分别多出一条亚克分子带(7.5kbp,14.7kbp)。在于其他毒株比较后,推测Cp GV-ZY可能存在该两种酶酶切位点的突变,可作为其鉴别特征。4.两株病毒在宿主中肠内转录组差异分析喂毒两株病毒后对宿主中肠进行了转录组分析,数据显示在喂毒后24h病毒在宿主中肠组织转录水平尚处于较低水平(2.69%~2.85%)。以M毒株为参照,对差异基因的表达量分析表明,只有orf20和orf91显著上调。其中orf20为颗粒体病毒所特有的基因,但其功能在后续的GO注释和KEGG注释中均为找到,这可能需要进一步做功能研究。orf91与编码ODV-E25的基因同源,属于病毒晚期表达基因,且为病毒核心基因,位于BV和ODV囊膜上,推测其在病毒系统侵染中具有重要作用。而半定量分析表明M毒株在宿主体内2d后的增殖中该基因处于高表达,这与平台期时M毒株拷贝数反而增高相符。由于本次实验只选取了一个时间点进行转录组测序,因此对于全面揭示病毒在宿主体内基因的差异表达还不够详尽。对于差异表达不明显的基因还可以继续关注。5.苹果蠹蛾颗粒体病毒紫外线保护剂应用基于前期的紫外线辐射模型,室内测试了两种氧化物Zn O和Ti O2添加后,幼虫死亡率比对照组分别提高55.8%和46.5%,结合田间的日照处理实验表明,Zn O(15mg/m L)和Ti O2(10mg/m L)可以显著提高Cp GV光稳定性。该研究为实现病毒农药田间持效性的提高提供可能。6.斑蝥素对苹果蠹蛾的毒性及生化特性斑蝥素是一种结构独特的昆虫防御性物质,本研究表明其对于苹果蠹蛾具有胃毒活性(LC50=0.057 mg/m L)和触杀活性(LC50=0.125 mg/m L),并且具有田间防治效果。低剂量饲喂下能导致幼虫体重增量减小,解毒酶GST活性显著提高、Car E和MFO显著下降而ACh E下降不显著。其作为一种有效的杀虫活性物质很有潜力在有机农业中用于苹果蠹蛾的生物防治。综上所述,本研究完成了苹果蠹蛾室内种群的饲养及评价,Cp GV在宿主体内增殖动态;从病毒形态角度证实Cp GV颗粒体大小与其紫外线耐受性直接相关,并且本土病毒Cp GV-ZY在形成大型颗粒体时并未减少最终病毒产量;限制性内切酶图谱分析表明本土病毒基因组存在两个酶切位点的突变,同时转录组分析发现有两个差异表达基因明显上调,但该突变位点及差异表达基因是否与病毒的环境适应性直接有关还需进一步研究。另外,在苹果蠹蛾的生物防治方面,完成了针对Cp GV的紫外线保护剂研究并证实动物源斑蝥素可用于该虫的防治。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S433.4;S476.13

【参考文献】